一种多粘类芽孢杆菌SP1及其应用的制作方法

一种多粘类芽孢杆菌sp1及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，更具体地，涉及一种多粘类芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.抗生素作为生长促进剂和治疗药物广泛应用于动物生产，以提高对传染病的抵抗力。然而，随着有效抗生素的缺乏和大量使用抗生素产生耐药性细菌等问题的出现，给人类健康带来很大的危害，为了维护我国动物源性食品安全和公共卫生安全，2020年7月1日起，我国畜禽饲料禁抗全面实施，开发无毒无害可持续生产的抗生素替代品已成为畜牧业的迫切需要。
3.抗菌肽是最有前途的抗生素替代品之一，作为一种新型的生物活性肽，它可以替代抗生素而发挥更广谱的抗菌作用，无或低耐药性，抗菌肽还具有杀灭癌细胞、抑制病毒等功能，同时也可作为免疫调节剂在调节机体免疫系统感染中发挥重要作用。因此抗菌肽在畜牧、医学、食品和化妆品等领域均有良好的应用前景。
4.多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)是一种产芽孢的g 细菌，对人和动植物无致病性，可产生多肽抗生素等多种生物活性物质，是一类极具开发前景和应用价值的生防细菌，可广泛应用于工业、医药、农业、食品等领域，我国农业部将其列为免做安全鉴定的一级菌种。
5.中国专利cn110484467b公开了一株产抗菌肽的多粘芽孢杆菌，该菌产生的抗菌肽分子量在5kda
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3kda(尤其分子量为4kda的抗菌肽a3)，且具有较好的稳定性。但是，该菌的抑菌谱仅有鸡大肠埃希氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、猪大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、牛金黄色葡萄球菌这几种；而且均为畜禽养殖常见菌，无在人皮肤致病菌的抑制用途。另外微生物菌也有退化的风险，因此，不断的充实有益菌库具有重要的意义。
6.另一方面，现有技术中多关注菌的产抗菌肽活性、抑菌活性，未考虑养殖饲料中脂肪类成分的不良影响问题。在家禽家畜类养殖中，尤其是对于幼仔，幼体和成体消化机能的成熟程度不同，存在着畜禽幼仔常因对脂肪类消化不足造成成活率低的问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种既能产抗菌肽、抑菌谱更广、又能产脂肪酶的菌株，尤其适用于生产禽畜及昆虫养殖饲料，并有望在人皮肤致病菌抑制的化妆品及药物方面应用。
8.本发明目的之一是提供一种多粘类芽孢杆菌sp1。
9.本发明另一目的是提供所述多粘类芽孢杆菌sp1的应用。
10.本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
11.一种产抗菌肽的多粘类芽孢杆菌，命名为多粘类芽孢杆菌sp1，所述多粘类芽孢杆菌sp1保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址是广东省科学院微生物研究所(广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏日期为2021年4月16日，保藏编号为gdmcc no：61605。
12.进一步的，所述的产抗菌肽的多粘类芽孢杆菌sp1，为革兰氏阳性的杆状细菌，有椭圆形端生内生芽孢。
13.进一步的，所述的产抗菌肽的多粘类芽孢杆菌sp1，在r2a平板上生长2天，菌落圆形，凸起，表面光滑，边缘整齐，半透明，粘稠状。
14.进一步的，所述的产抗菌肽的多粘类芽孢杆菌sp1，所述多粘类芽孢杆菌sp1的16s rdna长度为1406bp，16s rdna序列为seq id no.1所示。本发明多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)sp1的16s rdna的序列下所示，测序得到的16srdna序列为1406bp，用blast程序在genebank中与已登录的序列进行核苷酸同源性比较，该菌的16srdna序列与paenibacillus polymyxa(多黏类芽孢杆菌)同源性达99.50％；其形态特征及生理生化特征与paenibacillus polymyxa(多黏类芽孢杆菌)最相似。
15.进一步的，所述的产抗菌肽的多粘类芽孢杆菌sp1，可在yepd培养基上生长，其最适生长温度为30℃，最适生长环境的ph值为6.0～6.5。
16.进一步的，所述的产抗菌肽的多粘类芽孢杆菌sp1，多粘类芽孢杆菌sp1氧化酶试验呈阴性，h2s产生试验呈阴性，柠檬酸盐利用试验呈阴性，吲哚试验呈阴性，脲酶试验呈阴性。厌氧生长试验呈阳性，接触酶试验呈阳性，葡萄糖发酵试验呈阳性，硝酸盐还原试验呈阳性，阿拉伯糖发酵试验呈阳性，甘露醇发酵试验呈阳性，木糖发酵试验呈阳性，甘油发酵试验呈阳性，vp试验呈阳性,酪蛋白水解试验呈阳性，淀粉水解试验呈阳性。
17.本发明所述多粘类芽孢杆菌sp1能发酵产生抗菌肽，为替代抗生素提供依据。
18.进一步的，所述的产抗菌肽的多粘类芽孢杆菌sp1，其发酵产物具备高广谱的抗菌作用，对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌k12d31、大肠杆菌o78、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、苏云金杆菌、黑胸败血菌、肺炎克雷伯菌、痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、石膏样孢子菌、红色毛藓菌有抑菌抑制效果。
19.进一步的，所述的产抗菌肽的多粘类芽孢杆菌sp1，其发酵产物具有较高的脂肪酶活性，脂肪酶的活性为0.59u/ml。
20.进一步的，所述的产抗菌肽的多粘类芽孢杆菌sp1，及其发酵产物具备高较高的热稳定性，在生产上可应用于高温发酵。
21.因此，以下应用均应在本发明保护范围之内：
22.所述的产抗菌肽的多粘类芽孢杆菌sp1在生产抗菌肽和/或脂肪酶方面应用。
23.所述多粘类芽孢杆菌sp1在制备产抗菌肽和/或脂肪酶菌剂方面的应用。
24.所述多粘类芽孢杆菌sp1在制备抑菌剂方面的应用。
25.所述多粘类芽孢杆菌sp1在生产饲料方面的应用。可选地是发酵生产抑菌饲料。
26.所述的多黏类芽孢杆菌sp1在生产皮肤类抑菌药物方面的应用。
27.所述的多黏类芽孢杆菌sp1在生产祛痘类化妆品方面的应用。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29.本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌sp1：
30.(1)该菌能产抗菌肽；为替代抗生素提供依据。
31.(2)该菌具有较高且广谱的抗菌能力，对常见畜禽肠道菌致病菌均有抑制作用，对昆虫类如蚕类等养殖常见致病菌也有抑制作用；对人常见皮肤问题致病菌也有抑制作用。
32.(3)该菌能产脂肪酶，发酵产脂肪酶的活性为0.59u/ml；也可减少饲料中脂肪类物
质添加，节约成本，并为开发新型饲料添加剂提供了基础。可解决养殖畜禽幼仔对于脂肪类饲料的吸收问题，减少因油脂添加量过高而引起的消化不良和腹泻，同时促进脂肪的吸收，提高饲料利用率，改善畜禽生产性能，改善肠道健康，为开发新型饲料添加剂提供了基础。
33.(4)该菌及其发酵产物热稳定性强，应用前景好。
34.(5)该菌可以液态和固态培养，两种培养方式都能产生良好的抑菌作用，发酵后的上清液和沉淀均含抗菌物质。
附图说明
35.图1为多粘类芽孢杆菌sp1的菌落形态。
36.图2为多粘类芽孢杆菌sp1和相近菌株的16s rdna序列进行同源性比对构建的系统发育树。
具体实施方式
37.下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
38.实施例1菌株的分离、筛选
39.1.培养基选取：
40.lb培养基包括lb液体培养基和lb固体培养基。
41.lb液体培养基(1000ml)：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，用蒸馏水定容到1l，ph6.0～7.0，于121℃高压灭菌20min。
42.lb固体培养基(1000ml)：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，1.5％的琼脂粉，用蒸馏水定容到1l，ph6.0～7.0，于121℃高压灭菌20min。
43.2.菌株分离和筛选：
44.菌株的原始来源为从华南农业大学桑园的土壤中分离而来，采用琼脂孔扩散法，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，将灭菌后的lb培养基置室温待其冷却至48
‑
50℃时，吸取指示菌稀释液100μl，加入到10ml经溶解并冷却至40～50℃lb固体培养基中，立即倒入直径为90mm的培养皿中，迅速振荡摇匀，以使菌体均匀分散，待其冷却凝固后，用直径2.7mm的打孔器打孔，备用。每孔加入5ul的抑菌活性不确定的多粘类芽孢杆菌，静置30min后，于37℃培养24h，观察并测量抑菌圈大小，记录数据。经过抑菌活力的比较筛选，获得抑菌活性最高的菌株，记为菌株sp1。
45.实施例2菌株sp1的鉴定及生理生化指标测定
46.1、菌株菌落形态鉴定：
47.所述菌株sp1为革兰氏阳性的杆状细菌，有椭圆形端生内生芽孢。在r2a平板上生长2天，菌落圆形，凸起，表面光滑，边缘整齐，半透明，粘稠状(如图1)。
48.2、生理生化鉴定
49.参照《伯杰细菌鉴定手册》第九版和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠主编科学出版社)对sp1菌株进行生理生化鉴定：菌株sp1氧化酶试验呈阴性，h2s产生试验呈阴性，柠檬
酸盐利用试验呈阴性，吲哚试验呈阴性，脲酶试验呈阴性。厌氧生长试验呈阳性，接触酶试验呈阳性，葡萄糖发酵试验呈阳性，硝酸盐还原试验呈阳性，阿拉伯糖发酵试验呈阳性，甘露醇发酵试验呈阳性，木糖发酵试验呈阳性，甘油发酵试验呈阳性，vp试验呈阳性,酪蛋白水解试验呈阳性，淀粉水解试验呈阳性。
50.3、分子鉴定
‑‑
菌株16s rdna测序
51.对筛选得到的菌株sp1进行分子鉴定，通过委托广东省微生物分析检测中心对筛选得到的sp1的16s rdna进行测序。
52.菌株sp1的16srdna序列为1406bp，16s rdna序列为seq id no.1所示，用blast程序在genebank中与已登录的序列进行核苷酸同源性比较，构建系统发育树(图2)，该菌的16srdna序列与paenibacillus polymyxa(多黏类芽孢杆菌)同源性达99.50％；其形态特征及生理生化特征与paenibacillus polymyxa(多黏类芽孢杆菌)最相似。
53.因此，综上鉴定结果，鉴定菌株sp1属于多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)，并于2021年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址是广东省科学院微生物研究所(广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏编号为gdmcc no：61605。
54.实施例3菌株sp1最适温度和最适ph测定
55.1.yepd培养基包括yepd液体培养基和yepd液体培养基，其配方如下：
56.yepd液体培养基(1000ml):蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，葡萄糖20g/l，用蒸馏水定容到1l，ph＝6～7，于115℃高压灭菌20min。
57.yepd固体培养基(1000ml):蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，葡萄糖20g/l，1.5％的琼脂粉，用蒸馏水定容到1l，ph＝6～7，于115℃高压灭菌20min。
58.分别取7组yepd液体培养基，设置培养温度梯度分别为25℃；30℃；35℃；40℃温度下180r/min恒温摇床中培养24h得到菌液。通过计数发酵完成的菌液中菌密度，得到最优温度为30℃
59.分别取8组yepd液体培养基，运用盐酸和氢氧化钠调节培养基酸碱度，设置ph值梯度为ph＝2；ph＝4；ph＝6；ph＝7；ph＝8；ph＝10；ph＝12；ph＝14，控制温度在30℃下180r/min恒温摇床中培养24h得到菌液。通过计数发酵完成的菌液中菌密度，得到最优ph值为6
‑
7。
60.因此，多粘类芽孢杆菌sp1可在yepd培养基上生长，其最适生长温度为30℃，最适生长环境的ph值为6～7。
61.实施例4菌株sp1产脂肪酶活的测定
62.1、实验目的：
63.检测多粘类芽孢杆菌sp1代谢产物中是否含有脂肪酶，以便于在畜牧上更广泛的应用。
64.在饲料中添加脂肪酶，可提高动物日粮油脂的消化利用率，补充幼畜因消化机能尚未发育健全造成的内源性消化酶活性和分泌量的不足，减少因油脂添加量过高而引起的消化不良和腹泻，减少油脂用量，降低饲料成本。另外在昆虫类养殖中，昆虫对于脂肪的需求较高，富含脂肪酶的添加剂，可以促进昆虫对脂肪的吸收。
65.2、实验步骤：
66.(1)多粘类芽孢杆菌sp1的活化：在超净工作台中无菌操作，用接种环粘取一定量多粘类芽孢杆菌sp1，于yepd固体培养基上划线。30℃恒温倒置培养12～24h，直至有肉眼可见的单菌落。
67.(2)多粘类芽孢杆菌sp1菌液的制备：将活化的多粘类芽孢杆菌sp1单菌落接种于5～6ml yepd液体培养基中，于30℃、180r/min恒温摇床中培养24h作为种子菌液。
68.(3)酶活性标准曲线的绘制：称取0.08346g对硝基苯酚，先用少量95％乙醇溶解，然后用水定容至100ml，浓度为6mmol.。分别加入不同量的对硝基酚溶液和50mmo/l tris
‑
hcl(ph8.0)缓冲液，总体积为2ml。使体系中对硝基苯酚浓度为0umol/l、5umol/l、10umol/l、15umol/l、20umol/l、30umol/l、40umol/l、60umol/l、80umol/l、100umol/l。然后每管加入0.5ml10％三氯乙酸，再加入0.5ml10％na2co3溶液，总体积为3ml，410mm测定光吸收值。然后，绘制酶活性标准曲线。
69.(4)底物溶液a:90mg对
‑
棕桐酸硝基苯酯(p
‑
npp)溶丁30ml异丙醇，缓冲溶液b:50mmol/ltriscl(ph8.0)。取4支已标号试管，其中1管作空白对照，其他3管为反应管。将四试管中各加入溶液b1.8ml及0.2ml底物溶液a，37℃水浴保温5min，在对照管中加入yepd培养基1ml，样品管中加多粘类芽孢杆菌sp1菌液1ml，立即混匀计时，在水浴中准确反应10min后加入0.5ml10％三氯乙酸溶液终止反应，再加入0.5ml10％na2co3，溶液显色。410nm分光光度计下测定酶催化产生的对硝基苯酚的吸收值。脂肪酶1个酶活单位定义：在ph8.0，37℃条件下，每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(u)。
70.实验结果表明，多粘类芽孢杆菌sp1发酵产脂肪酶的活性为0.59u/ml，多粘类芽孢杆菌sp1发酵具有较高的脂肪酶产出量和活性。
71.实施例5抑菌作用测定
72.1.病菌的选取
73.金黄色葡萄球菌：革兰氏阳性菌，为常见食源性致病微生物，分布范围广泛，能产生肠毒素，对于畜禽养殖及人类均有不同程度危害。
74.大肠杆菌k12d31、大肠杆菌o78：畜禽类常见肠道革兰氏阴性菌，对畜禽类肠道产生感染，可引起急性腹泻，不利于畜禽健康。
75.鼠伤寒沙门氏菌：存在于家禽、家畜、鼠类等多种动物的肠道，是引起急性胃肠炎、伤寒的主要病原菌之一。
76.猪霍乱沙门氏菌：是引起仔猪副伤寒的主要病原菌，给养猪业造成重大危害。
77.苏云金杆菌：最广泛的微生物杀虫剂。苏云金杆菌的防虫原理是其菌株可产生内毒素(伴胞晶体)和外毒素两类毒素，使害虫停止取食，害虫均因饥饿、血液败坏和神经中毒而死，对各种蚕类有高毒性，可导致蚕的猝倒病。
78.黑胸败血菌抑菌：黑胸败血芽胞杆菌(bacillus bombyseptieus,bb)是家蚕(bombyx mori)的致病菌,对各种蚕类有高毒性，可导致蚕的败血病。
79.肺炎克雷伯菌：肺炎克雷伯菌存在于人体上呼吸道和肠道，引起人类严重的感染，包括肺炎，尿路感染和血液感染。
80.痤疮丙酸杆菌：一般寄居在皮肤的毛囊及皮脂腺中，是造成青春痘痤疮的主要细菌。
81.表皮葡萄球菌：在人体的皮肤，阴道等部位寄生，可引起慢性炎症性皮肤病和泌尿
系统感染等疾病。
82.石膏样孢子菌：属于小孢子菌属，可引发人和动物产生皮肤癣等一系列真菌感染病害。
83.红色毛藓菌：是一种人源的皮癣菌，引起常见的皮肤浅部真菌病，如手癣、足癣、头癣等。
84.2.实验实施：
85.(1)琼脂孔扩散法检测抑菌圈的大小。方法简述如下：将灭菌后的lb培养基置室温待其冷却至48
‑
50℃时，吸取指示菌稀释液100μl，指示菌分别取：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌k12d31、大肠杆菌o78、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱沙门氏菌、苏云金杆菌、黑胸败血菌抑菌。
86.将指示菌稀释液加入到10ml经溶解并冷却至40～50℃lb固体培养基中，立即倒入直径为90mm的培养皿中，迅速振荡摇匀，以使菌体均匀分散，待其冷却凝固后，用直径2.7mm的打孔器打孔，备用。每孔加入5ul的多粘类芽孢杆菌sp1，静置30min后，于37℃培养24h，观察并测量抑菌圈大小，并记录数据。
87.(2)滤纸片法：取一定量痤疮丙酸杆菌，加适量无菌水稀释，充分混匀，吸取100μl均匀涂布。取一直径为5mm的无菌滤纸片放于培养皿中心，滴加5μl的多粘类芽孢杆菌sp1，静置15min后于37℃厌氧环境中，倒置培养48h，观察并测量抑菌圈大小，记录数据。
88.以表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯菌作为指示菌，加入到lb固体培养基中，待冷却凝固，之后步骤同上。
89.(3)生长速率测定法：在pda平板表面加100μl多粘类芽孢杆菌sp1，涂布均匀，待吸收后在平皿中央接种直径5mm的真菌菌柄，指示菌为石膏样孢子菌、石膏样孢子菌，以等量无菌去离子水做对照。于25～28℃恒温培养箱中，倒置培养5～7天，其中每隔24h观察其生长情况，观察并记录菌落大小。比较多粘类芽孢杆菌sp1对两种真菌菌丝的抑制作用，并计算抑制率(ir)。
90.ir＝[(ck菌盘平均直径
‑
处理菌盘平均直径)/ck菌盘平均直径]
×
100％
[0091]
3、实验结果
[0092]
实验结果表明(如表1)：多粘类芽孢杆菌sp1发酵产物具备较高广谱的抗菌作用，对常见畜禽肠道菌致病菌有抑制作用，对昆虫类养殖常见致病菌有抑制作用，对常见皮肤问题致病菌有抑制作用。
[0093]
表1多粘类芽孢杆菌sp1固体培养基抑菌作用测试
[0094]
病菌抑菌圈直径(抑制率)金黄色葡萄球菌16.45mm大肠杆菌k12d319.28mm大肠杆菌o7810.73mm鼠伤寒沙门氏菌9.83mm猪霍乱沙门氏菌9.30mm苏云金杆菌11.5mm黑胸败血菌9.00mm肺炎克雷伯菌8.15mm痤疮丙酸杆菌7.98mm
表皮葡萄球菌18.41mm石膏样孢子菌90.38％红色毛藓菌72％
[0095]
实施例6菌株sp1热稳定性测定
[0096]
将灭菌后的lb培养基置室温待其冷却至48
‑
50℃时，吸取指示菌稀释液100μl，指示菌取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌k12d31。将指示菌稀释液加入到10ml经溶解并冷却至40～50℃lb固体培养基中，立即倒入直径为90mm的培养皿中，迅速振荡摇匀，以使菌体均匀分散，待其冷却凝固后，用直径2.7mm的打孔器打孔，备用。将多粘类芽孢杆菌sp1于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴锅中各水浴加热10min。以未加热处理的菌液作空白对照，每孔加入5ul的多粘类芽孢杆菌sp1，静置30min后，于37℃培养24h，观察并测量抑菌圈大小，并记录数据。
[0097]
对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径如表2所示:
[0098]
表2不同温度下菌株sp1对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌k12d31抑菌测试
[0099][0100][0101]
因此，多粘类芽孢杆菌sp1发酵产物具备高较高的热稳定性。试验结果表明：多粘类芽孢杆菌sp1热稳定性强。
[0102]
实施例7上清液和沉淀的热稳定性测定
[0103]
将多粘类芽孢杆菌sp1发酵液离心，上清液和菌体沉淀分别于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴锅中各水浴加热10min，以未加热处理的菌液作空白对照，采用琼脂孔扩散法同实验六，观察并测量抑菌圈大小，并记录数据。
[0104]
表3不同温度下菌株sp1上清液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌k12d31抑菌测试
[0105][0106]
表4不同温度下菌株sp1菌体沉淀对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌k12d31抑菌测试
[0107][0108][0109]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。