用于制备抗体-载荷部分偶联物的化合物及其用途的制作方法

用于制备抗体
‑
载荷部分偶联物的化合物及其用途
技术领域
1.本发明涉及生物偶联领域。本发明涉及用于制备位点特异性结合的抗体
‑
载荷部分(payload)偶联物的接头、使用该接头制备的抗体
‑
载荷部分偶联物以及制备抗体
‑
载荷部分偶联物的方法。更具体地，本发明涉及接头，其中所述接头包含羰基碳，所述羰基碳具有两个或多个不同的部分正电荷并且在两端具有官能团，并且可以通过取代反应将化合物、肽和/或蛋白质连接至生物(目标)分子。


背景技术：

2.生物偶联是连接至少两个或多个分子的过程，在此情况下，生物偶联是指其中至少一个或多个分子是生物活性分子的过程。生物活性分子有时可称为“目标分子”或“感兴趣的分子”，并且可为例如蛋白质(或肽)、聚糖、核酸(或寡核苷酸)、脂质、激素或天然药物(或其片段，或其组合)等。这种连接两个或多个分子的接头可通过将例如抗体的目标特异性蛋白质结合到荧光材料等而被广泛用于检测、诊断、生物标记物等。
3.目前，对于作为生物偶联物用于检测、诊断、治疗等的接头，例如，聚乙二醇(peg)被广泛地在商业上使用，这是因为peg高度水溶性、无毒性、非抗原性并且不凝聚。最近，随着通过对将细胞毒性药物(抗癌药物)连接到抗体来治疗特定疾病的治疗剂的兴趣增加，关于能够将细胞毒性药物结合到目标分子(例如抗体)的接头的研究也在积极地进行。对于能够连接这两个或多个分子的接头，体内血液稳定性、相容性、溶解性、目标特异性等均需要考虑。
4.同时，目前在抗体
‑
载荷部分偶联物领域研究的接头存在着抗体长度和大小降低其生物活性的问题。例如，存在例如通过阻断fcrn受体结合而降低半衰期以及由于难以位点特异性结合而难以产生同类抗体
‑
药物偶联物的问题。因此，迫切需要开发一种在维持目标分子活性的同时具有优异的体内血液稳定性、相容性、溶解性和位点特异性的接头。
5.为了解决这些问题，本发明的发明人发明了一种接头，所述接头能够将载荷部分连接到目标分子而不影响目标分子的生物活性，所述接头包含具有两个或多个不同的部分正电荷(δ )的羰基以及在两端的离去基团和/或点击化合物(click compound)。不仅可以通过增加位点特异性，还可以通过长度调节增加目标分子的水溶性，来增加接头的反应性。由于这样的接头不具有严苛的反应条件并且作为生物偶联物对于包含目标分子的分子具有高偶联率，因此旨在提供更稳定且经济高效的接头。


技术实现要素：

6.技术问题
7.本技术提供了具有新型反式结构的接头及其制备方法，所述新型反式结构的接头包含一个或多个点击化学部分和羰基的两个或多个亲电碳。
8.本技术提供了具有新型顺式结构的接头及其制备方法，所述新型顺式结构的接头包含一个或多个点击化学部分和羰基的两个或多个亲电碳。
9.技术手段
10.为了解决本技术的上述问题，本说明书提供了一种接头，所述接头有助于转送和结合反应，以便直接和/或间接地将载荷部分连接到目标分子。
11.在一方面，本技术提供了由以下式2表示的化合物：
12.[式2]
[0013][0014]
式2中，r'为酯基活化部分，r”为乙炔基团、反式环辛烯基团、环辛炔基团、二芳基环辛炔基团、甲基酯膦化物(methyl ester phosphine)基团、降冰片烯基团、甲基环丙烯基团、氮杂环丁烯基团和氰化物基团中的任一种，r”'为取代或未取代的c1‑
20
亚烷基、取代或未取代的c2‑
20
亚烯基、取代或未取代的c1‑
10
亚炔基、取代或未取代的c1‑
10
聚亚甲基、取代或未取代的c5‑
12
芳基、取代或未取代的c5‑
14
芳基亚烷基、取代或未取代的c8‑
16
芳基亚烯基、取代或未取代的c3‑
10
环亚烷基、取代或未取代的c3‑
10
杂环亚烷基、或取代或未取代的c5‑
12
杂芳基，且杂亚烷基、杂环亚烷基或杂芳基包含选自于由n、o和s组成的组的至少一种或多种，所述取代为非氢取代基取代，所述非氢取代基为选自于由
‑
ra、
‑
o
‑
、＝o、
‑
ora、
‑
sra、
‑
s
‑
、
‑
n(ra)2、＝nra、
‑
c(rb)3、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
n3、
‑
nhc(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝o)nrara、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2ra、
‑
os(＝o)2ora、
‑
s(＝o)2nra、
‑
s(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、亚烷基
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝s)ra、
‑
c(＝o)ora、亚烷基
‑
c(＝o)ora、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)ora、
‑
c(＝o)sra、
‑
c(＝s)sra、
‑
c(＝o)nrara、亚烷基
‑
c(＝o)nrara、
‑
c(＝s)nrara、
‑
c(
‑
nra)nrara和rb组成的组的任一种或多种，ra为h、c1‑6烷基、c5‑
12
芳基、c7‑
12
芳烷基或杂环基团，rb为f、cl、br或i，x为o、n或s。此外，本技术提供其中r”选自于由降冰片烯基团、反式环辛烯基团、环辛炔基团和甲基环丙烯基团组成的组的化合物。此外，本技术提供其中r”为降冰片烯基团的化合物。
[0015]
此外，本技术提供了一种化合物，其中r”'选自于由取代或未取代的c1‑
10
亚烷基、取代或未取代的c1‑
10
杂亚烷基和c1‑
10
聚亚甲基组成的组，所述杂亚烷基包含选自于由n、o和s组成的组的至少一种或多种，所述取代为非氢取代基取代，所述非氢取代基为选自于由
‑
o
‑
、＝o、
‑
ora、
‑
sra、
‑
s
‑
、
‑
n(ra)2、＝nra、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
n3、
‑
nhc(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝o)nrara、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2ra、
‑
os(＝o)2ora、
‑
s(＝o)2nra、
‑
s(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、亚烷基
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝s)ra、
‑
c(＝o)ora、亚烷基
‑
c(＝o)ora、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)ora、
‑
c(＝o)sra、
‑
c(＝s)sra、
‑
c(＝o)nrara、亚烷基
‑
c(＝o)nrara、
‑
c(＝s)nrara和
‑
c(
‑
nra)nrara组成的组的任一种或多种，ra为c1‑6烷基、c5‑
12
芳基、c7‑
12
芳烷基或杂环基团，rb为f、cl、br或i，x为o、n或s。此外，本技术提供了其中r”'为未取代的c1‑5亚烷基或未取代的c1‑5聚亚甲基的化合物。
[0016]
此外，本技术提供了其中x为o的化合物。
[0017]
此外，本技术提供了一种化合物，其中式2的化合物由以下式2
‑1‑
2表示：
[0018]
[式2
‑1‑
2]
[0019][0020]
在另一方面，本技术提供了一种用于制备抗体
‑
载荷部分偶联物的方法，所述方法包括：通过使具有式2结构的接头与fc结合肽反应来制备接头
‑
fc结合肽偶联物；使接头
‑
fc结合肽偶联物与抗体反应以获得包含第一点击化学官能团的抗体；以及通过使包含第一点击化学官能团的抗体与包含能够与第一点击化学官能团进行点击化学反应的第二点击化学官能团的载荷部分反应，制备具有以下式8结构的抗体
‑
载荷部分偶联物：
[0021]
[式8]
[0022][0023]
其中，ab为抗体，r”'为未取代的c1‑5亚烷基或未取代的c1‑5聚亚甲基，y4为n，fp为fc结合肽，b为由第一点击化学官能团和第二点击化学官能团的点击化学反应形成的任一种结构，am是活性部分或包含活性部分的结构，其中活性部分是选自于由药物分子、成像部分、光学剂、维生素和毒素组成的组中的任一种，n为1以上且4以下的整数。
[0024]
此外，本技术提供了制备抗体
‑
载荷部分偶联物的方法，其中fc结合肽是选自于由下式13和式14组成的组的肽，
[0025]
其中，
[0026]
[式13]
[0027]
d
‑
c
‑
a
‑
w
‑
h
‑
xa
‑
g
‑
e
‑
l
‑
v
‑
w
‑
c
‑
t
[0028]
[式14]
[0029]
d
‑
c
‑
a
‑
w
‑
h
‑
k
‑
g
‑
f
‑
l
‑
v
‑
w
‑
c
‑
t
[0030]
其中，d为天冬氨酸，c为半胱氨酸，a为丙氨酸，w为色氨酸，h为组氨酸，xa为
g为甘氨酸，e为谷氨酸，l为亮氨酸，v为缬氨酸，t为苏氨酸，k为赖氨酸，其中，m为1以上且4以下的整数，处于n
‑
端的半胱氨酸和处于c
‑
端的半胱氨酸彼此选择性地连接，n＝2，并且连接到ab的氮原子包含在抗体的两种fc的246位赖氨酸或248位赖氨酸中。
[0031]
在另一方面，本技术提供了以下式8的抗体
‑
载荷部分偶联物：
[0032]
[式8]
[0033][0034]
其中，ab为抗体，r
″′
为未取代的c1‑5亚烷基或未取代的c1‑5聚亚甲基，y4为n，fp为fc结合肽，b为由第一点击化学官能团和第二点击化学官能团的点击化学反应形成的任一种结构，am是活性部分或包含活性部分的结构，其中活性部分是选自于由药物分子、成像部分、光学剂、维生素和毒素组成的组中的任一种，n为1以上且4以下的整数。
[0035]
此外，本技术提供了一种抗体
‑
载荷部分偶联物，其中fp是选自于由以下式13和式14组成的组的肽，
[0036]
其中，
[0037]
[式13]
[0038]
d
‑
c
‑
a
‑
w
‑
h
‑
xa
‑
g
‑
e
‑
l
‑
v
‑
w
‑
c
‑
t
[0039]
[式14]
[0040]
d
‑
c
‑
a
‑
w
‑
h
‑
k
‑
g
‑
e
‑
l
‑
v
‑
w
‑
c
‑
t
[0041]
其中，d为天冬氨酸，c为半胱氨酸，a为丙氨酸，w为色氨酸，h为组氨酸，xa为g为甘氨酸，e为谷氨酸，l为亮氨酸，v为缬氨酸，t为苏氨酸，k为赖氨酸，其中，m为1以上且4以下的整数，处于n
‑
端的半胱氨酸和处于c
‑
端的半胱氨酸彼此选择性地连接，fp在氨基酸残基6处通过y4连接。
[0042]
此外，本技术提供了一种抗体
‑
载荷部分偶联物，其中b为
其中a1连接到抗体且a2连接到am，或者a1连接到am且a2连接到抗体。此外，本技术提供了一种抗体
‑
载荷部分偶联物，其中b为
[0043]
进一步地，本技术提供了一种抗体
‑
载荷部分偶联物，其中am包含抗癌药物。此外，本技术提供了一种抗体
‑
载荷部分偶联物，其中抗癌药物为美登素(mertansine；dm1)。进一步地，本技术提供了一种抗体
‑
载荷部分偶联物，其中am包含两种或多种抗癌药物。
[0044]
进一步地，本技术提供了一种抗体
‑
载荷部分偶联物，其中连接到ab的氮原子包含在抗体的fc的246位赖氨酸或248位赖氨酸中。
[0045]
进一步地，本技术提供了一种抗体
‑
载荷部分偶联物，其中n为2，并且连接到ab的氮原子包含在抗体的两个fc的246位赖氨酸或248位赖氨酸中。
[0046]
在另一方面，本技术提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，其中所述药物组合物包含含有抗癌药物的抗体
‑
载荷部分。
[0047]
此外，本技术提供了一种药物组合物，其中所述癌症为乳腺癌。
[0048]
有益效果
[0049]
根据本说明书公开的技术，存在以下效果。
[0050]
本文所公开的化合物1提供了一种能够将载荷部分与抗体进行位点特异性连接的接头。所述接头具有不影响例如抗体半衰期的生物活性的效果，并且可以有用地用作检测、诊断、生物标记物和抗癌治疗剂的生物偶联物。
[0051]
此外，本文所公开的化合物2提供了一种能够将载荷部分与抗体进行位点特异性连接的接头。所述接头可以影响目标分子的生物活性，并且具有例如降低目标分子和/或载荷部分的半衰期或促进分泌的效果。所述接头可用作用于检测、诊断和生物标记物的生物偶联物。
[0052]
此外，由化合物1和化合物2提供的抗体
‑
载荷部分偶联物由于具有一致的结合位置而具有高度一致性的优点。
附图说明
[0053]
图1示出了化合物i(反式)的整个合成过程。
[0054]
图2示出了化合物ii(顺式)的整个合成过程。
[0055]
图3示出了化合物6的异构体结构的hplc光谱分析的结果。
[0056]
图4示出了化合物6(顺式)的分子量分析的结果。
[0057]
图5示出了化合物6(反式)的分子量分析的结果。
[0058]
图6示出了通过hplc确认化合物ii的异构体结构的结果。
[0059]
图7示出了通过hplc获得化合物ii的结果。
[0060]
图8示出了fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的hplc结果。
[0061]
图9示出了fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的lc质量结果。
[0062]
图10示出了化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的hplc结果。
[0063]
图11示出了化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的lc质量结果。
[0064]
图12示出了化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的hplc结果。
[0065]
图13示出了化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的质谱仪结果。
[0066]
图14示出了化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯与抗体的反应。
[0067]
图15示出了由化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯与抗体反应生成的ab(lys 246/248)
‑
降冰片烯的结构。
[0068]
图16示出了通过hic
‑
hplc对化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯与抗体的反应进行反应监测的结果。
[0069]
图17示出了化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯与抗体的反应。
[0070]
图18示出了由化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯与抗体反应生成的ab(lys 246/248)
‑
降冰片烯的结构。
[0071]
图19示出了通过hic
‑
hplc对化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯与抗体的反应进行反应监测的结果。
[0072]
图20示出了赫赛汀(herceptin)
‑
降冰片烯的质量分析结果。
[0073]
图21示出了使用图18中包含第一点击化学官能团的抗体生成的抗体
‑
载荷部分偶联物的结构。放大的结构是载荷部分的结构，并且未放大的部分与图18中示出的结构相同。
[0074]
图22示出了通过hic
‑
hplc对图18中ab(lys 246/248)
‑
降冰片烯与四嗪
‑
peg8
‑
dm1的反应进行反应监测的结果。
[0075]
图23示出了抗体
‑
载荷部分偶联物的质量分析结果。
[0076]
图24、25、26和27分别是nci
‑
n87、bt474和mda
‑
mb
‑
468的细胞毒性实验的结果，以及总结结果的表格。
[0077]
图28和图29示出了本技术所述的赫赛汀和抗体
‑
载荷部分偶联物的肿瘤生长抑制实验的结果。
[0078]
图30示出了化合物ii
‑
fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯的hplc结果。
[0079]
图31示出了化合物ii
‑
fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯的质谱仪结果。
[0080]
图32示出了化合物ii
‑
fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯的hplc结果。
[0081]
图33示出了化合物ii
‑
fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯的质谱仪结果。
[0082]
图34示出了化合物ii
‑
fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯的hplc结果。
[0083]
图35示出了化合物ii
‑
fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯的质谱仪结果。
[0084]
图36示出了化合物ii
‑
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯的hplc结果。
[0085]
图37示出了化合物ii
‑
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯的质谱仪结果。
[0086]
图38示出了用于监测与化合物ii
‑
fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯基抗体的结合反应的hic
‑
hplc结果。
[0087]
图39示出了用于监测与化合物ii
‑
fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯基抗体的结合反应的hic
‑
hplc结果。
[0088]
图40示出了用于监测与化合物ii
‑
fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯基抗体的结合反应的hic
‑
hplc结果。
[0089]
图41示出了用于监测与化合物ii
‑
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯基抗体的结合反应的hic
‑
hplc结果。
具体实施方式
[0090]
术语“杂烷基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子(例如o、n或s)取代的烷基。例如，当连接于母体分子的烷基的碳原子被杂原子(例如，o、n或s)取代时，所得的杂烷基分别为烷氧基(例如，
‑
och3等)、胺(例如，
‑
nhch3、
‑
n(ch3)2等)或硫烷基(例如，
‑
sch3)。当不连接于母体分子的烷基的非末端碳原子被杂原子(例如，o、n或s)取代时，所得的杂烷基分别为烷基醚(例如，
‑
ch2ch2‑
o
‑
ch3等)、烷基胺(例如，
‑
ch2nhch3、
‑
ch2n(ch3)2等)或烷基硫醚(例如，
‑
ch2‑
s
‑
ch3)。当烷基的末端碳原子被杂原子(例如，o、n或s)取代时，所得的杂烷基分别为羟烷基(例如，
‑
ch2ch2‑
oh)、氨烷基(例如，
‑
ch2nh2)或烷基硫醇(例如，
‑
ch2ch2‑
sh)。杂烷基可具有例如1至20个碳原子、1至10个碳原子或1至6个碳原子。c1‑
c6杂烷基指具有1至6个碳原子的杂烷基。
[0091]
术语“亚烷基”是指通过从母体烷烃的相同或两个不同碳原子中去除两个氢原子而得到的支链、直链或环状的饱和烃基团，包括两个一价基团中心。例如，亚烷基可具有1至20个碳原子、1至10个碳原子或1至6个碳原子。典型的亚烷基基团包括亚甲基(
‑
ch2‑
)、1,1
‑
乙基(
‑
ch(ch3)
‑
)、1,2
‑
乙基(
‑
ch2ch2‑
)、1,1
‑
丙基(
‑
ch(ch2chv)
‑
)、1,2
‑
丙基(
‑
ch2ch(ch3)
‑
)、1,3
‑
丙基(
‑
ch2ch2ch2‑
)、1,4
‑
丁基(
‑
ch2ch2ch2ch2‑
)等，但不限于此。
[0092]
术语“亚烯基”是指通过从母体烯烃的相同或两个不同碳原子中去除两个氢原子而得到的支链、直链或环状的不饱和烃基团，包括两个一价基团中心。例如，亚烯基基团可具有1至20个碳原子、1至10个碳原子或1至6个碳原子。典型的亚烯基基团包括1,2
‑
乙烯(
‑
ch＝ch
‑
)，但不限于此。
[0093]
术语“亚炔基”是指通过从母体炔烃的相同或两个不同碳原子中去除两个氢原子而得到的支链、直链或环状的不饱和烃自由基，包括两个一价自由基中心。例如，亚炔基基团可具有1至20个碳原子、1至10个碳原子或1至6个碳原子。典型的亚炔基基团包括乙炔基(
‑
c≡c
‑
)、炔丙基(
‑
ch2c≡c
‑
)和4
‑
戊炔基(
‑
ch2ch2ch2c≡c
‑
)，但不限于此。
[0094]
术语“聚亚甲基”是指具有一个或多个碳原子的亚烷基，包括亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基和七亚甲基。
[0095]
本领域技术人员将认识到，当例如“烷基”、“芳基”和“杂环基”的部分被一个或多个取代基取代时，它们可被选择性地称为例如“亚烷基”、“亚芳基”和“亚杂环基”的部分(即，它意味着母体“烷基”、“芳基”和“杂环基”部分的一个或多个氢原子被所述取代基取代)。当例如“烷基”、“芳基”和“杂环基”的部分在本技术中被称为“取代”或在附图中被图示为取代(或任选地取代，例如，当取代基的数目为0至正数时)，例如“烷基”、“芳基”和“杂环基”的术语应理解为可与“亚烷基”、“亚芳基”、“亚杂环基”等互换。
[0096]
术语“酰基”是指
‑
c(＝o)
‑
烷基、
‑
c(＝o)
‑
碳环(取代或未取代)、
‑
c(＝o)
‑
杂环(取
代或未取代)，其中，其烷基、碳环或杂环部分与本技术中所定义的相同。“酰基”的非限制性实例包括
‑
c(＝o)ch3、
‑
c(＝o)ch2ch3、
‑
c(＝o)ch(ch3)2、
‑
c(＝o)c(ch3)3、
‑
c(＝o)
‑
苯基(取代或未取代)、
‑
c(＝o)
‑
环丙基(取代或未取代)、
‑
c(＝o)
‑
环丁基(取代或未取代)、
‑
c(＝o)
‑
环戊基(取代或未取代)、
‑
c(＝o)
‑
环己基(取代或未取代)、
‑
c(＝o)
‑
吡啶基(取代或未取代)等。
[0097]
术语“取代”，例如，“取代的烷基”、“取代的亚烷基”、“取代的芳基”、“取代的芳烷基”、“取代的杂环基”和“取代的碳环基(例如，取代的环烷基)”是指其中一个或多个氢原子各自独立地被非氢取代基取代的烷基、亚烷基、芳基、芳烷基、杂环基和碳环基(例如，环烷基)。典型的取代基包括
‑
x、
‑
r、
‑
o
‑
、＝o、
‑
or、
‑
sr、
‑
s
‑
、
‑
nr2、
‑
n

r3、＝nr、
‑
c(x)3、
‑
cn、
‑
ocn、
‑
scn、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
n3、
‑
nhc(＝o)r、
‑
c(＝o)r、
‑
c(＝o)nrr、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2r、
‑
os(＝o)2or、
‑
s(＝o)2nr、
‑
s(＝o)r、
‑
op(＝o)(or)2、
‑
c(＝o)r、亚烷基
‑
c(＝o)r、
‑
c(s)r、
‑
c(＝o)or、亚烷基
‑
c(＝o)or、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)or、
‑
c(＝o)sr、
‑
c(＝s)sr、
‑
c(＝o)nrr、亚烷基
‑
c(＝o)nrr、
‑
c(＝s)nrr、
‑
c(
‑
nr)nrr(在此，x各自独立地为卤素：f、cl、br或i，并且r独立地为h、烷基、芳基、芳烷基或杂环基团)，但不限于此。亚烷基、亚烯基和亚炔基也可以类似地被取代。
[0098]“任选取代的”是指具有一个、两个或多个取代基(例如，任选取代的芳基)的式1化合物的特定部分。
[0099]“离去基团”代表可以被其它化学基团脱去或替换的化学部分。在本发明的整个说明书中，术语离去基团包括点击化学官能团、n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)或马来酰亚胺，但不限于此。
[0100]
术语“目标分子”或“感兴趣的分子”是指旨在将载荷部分连接到其上的分子。例如，目标分子可以为生物活性分子，并且可以为例如蛋白质(或肽)、聚糖、核酸(或寡核苷酸)、脂质、激素或天然药物(或其片段，或其组合)，但不限于此。
[0101]
术语“载荷部分”是指旨在被连接到目标分子上的分子。例如，载荷部分可以为化合物、肽、多肽、蛋白质和/或药物分子。
[0102]
术语“点击化学官能团”是指参与点击化学反应的官能团。点击化学的类型及其所涉及的官能团通常是公知的。点击化学反应的实例包括[3 2]环加成、硫醇烯反应、diels
‑
alder反应、逆电子需求diels
‑
alder反应、[4 1]环加成等，但不限于此。更具体地，点击化学反应包括铜(i)催化的叠氮化物
‑
炔烃环加成(cuaac)、力引发的叠氮化物
‑
炔烃环加成(spaac)、力引发的炔烃
‑
硝基环加成(spanc)、烯烃和叠氮化物的[3 2]环加成、烯烃和四嗪的逆需求diels
‑
alder、烯烃和四唑的光点击反应，以及叠氮化物和炔烃的huisgen环加成，但不限于此。点击化学官能团包括如下的基团：炔烃、环炔烃、环辛炔和环壬炔(例如环炔烃，如双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯、亲二烯体，以及例如环辛炔、环壬炔、二苯并环辛炔(dibo)、二芳基氮杂环辛炔酮(biarylazacyclooctynone，barac)、无芳基辛炔(alo)、二氟化环辛炔(difo)、单氟化环辛炔(mofo)、二苯并氮杂环辛炔(dibac)和二甲氧基氮杂环辛炔(dimac)的环炔烃，但不限于此。
[0103]
术语“酯基活化部分”统称为与酯基的氧相连的部分，因此可以将酯基转化为活化
酯。例如，当具有结构的酯基是活化酯时，z是酯基活化部分。例如，酯基活化部分包括n
‑
羟基琥珀酰亚胺基(nhs)、对硝基苯基和五氟苯基，但不限于此。本发明的酯基活化部分包括wo/2015/122478中提及的内容，但不限于此。术语“活化酯”是指对亲核取代反应敏感的酯。
[0104]
在本说明书中，使用诸如第一和第二之类的术语用于描述各种成分，并且上述术语仅用于区分一个成分和另一个成分的目的。
[0105]
进一步地，应当注意，在本说明书中使用的术语仅用于描述示例性的实施方式，并不旨在限制本发明。除非上下文另有明确说明，单数表达包括复数表达。
[0106]
在本说明书中，诸如“包含”、“包括”或“具有”之类的术语旨在表示存在应用的特征、数字、步骤、操作、组成元素或它们的任意组合，并且应当理解为意味着不排除存在或添加一个或多个其它特征、数字、步骤、操作、组成元素或它们的任意组合的可能性。
[0107]
由于本说明书可以被修改为各种形式并且包括各种示例性实施方式，因此将在下面详细说明和描述具体的示例性实施方式。然而，说明书并不旨在将本发明限制于具体公开内容，并且应当理解，包括在本发明的思想和技术范围中的所有改变、等价物和替换都包括在本发明中。
[0108]
在下文中，将详细描述本发明。
[0109]
本技术可提供有助于转送和结合反应的接头，使得载荷部分可连接到期望的目标分子。
[0110]
接头可包括能够与载荷部分和/或目标分子反应的两个或多个官能团。
[0111]
上述反应是指两个或多个相同或不同的分子或分子的某些官能团相互连接，或发生离去反应，即e1、e2、sn1、sn2和亲核取代反应等。连接包括所有直接或间接共价和/或非共价键。
[0112]
在一个实例中，两个或多个官能团中的第一官能团可以为离去基团。
[0113]
在一个实例中，两个或多个官能团中的第二官能团可为点击化学官能团。
[0114]
接头可包括羰基的两个或多个亲电碳原子。
[0115]
羰基的亲电碳原子可与官能团相连。
[0116]
作为一个实例，羰基的亲电碳原子和官能团可以共价键合。
[0117]
作为另一个实例，一个或多个原子可包括在羰基的亲电碳原子和官能团之间。例如，亲核原子可以包括在羰基的亲电碳原子和官能团之间。在此情况下，亲核原子可以为o(氧)、n(氮)或s(硫)。
[0118]
接头可包括羰基的两个或多个亲电碳原子，其具有不同的部分正电荷(δ )。
[0119]
在羰基的两个或多个亲电碳原子中，具有最大部分正电荷(δ )的羰基可以为第一个羰基碳原子。
[0120]
在羰基的两个或多个亲电碳原子中，具有第二大部分正电荷(δ )的羰基可以为第二个羰基碳原子。
[0121]
作为一个实例，第一羰基的亲电碳原子可连接至第一官能团。在此情况下，亲核原子可包含在第一羰基的亲电碳原子和第一官能团之间。
[0122]
作为另一个实例，第二羰基的亲电碳原子可连接至第二官能团。在此情况下，第二羰基的亲电碳原子可与第一官能团形成共价键。
[0123]
接头可以调整将要共价结合至目标分子的载荷部分的结合位置。
[0124]
例如，载荷部分可连接至第一羰基的亲电碳原子。
[0125]
接头的水溶性可通过长度调节来调节。例如，可通过增加包含可增加水溶性的取代基的烷基的数目来增加接头的水溶性。
[0126]
在下文中，将详细描述接头结构。
[0127]
根据本文公开的一个方面，可提供由以下式1和/或式2表示的接头化合物。
[0128]
[式1]
[0129][0130]
[式2]
[0131][0132]
在式1中，
[0133]
r'是酯基活化部分。酯基活化部分包括n
‑
羟基琥珀酰亚胺基(nhs)、对硝基苯基和五氟苯基，但不限于此。此外，r'可以为r'可以为的任一种。
[0134]
r”为点击化学官能团中的任一种，并且
[0135]
点击化学官能团可以为炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体中的任一种或多种基团，但不限于此。
[0136]
当点击化学官能团是环炔烃基团时，环炔烃基团可以为环辛炔、环壬炔、二苯并环辛炔(dibo)、二芳基氮杂环辛炔酮(barac)、无芳基辛炔(alo)、二氟化环辛炔(difo)、单氟化环辛炔(mofo)、二苯并氮杂环辛炔(dibac)和二甲氧基氮杂环辛炔(dimac)中的任一种基团。环炔烃基团不限于此。
[0137]
当化学官能团为共轭二烯基团时，共轭二烯基团可以为烯烃基团和环烷烃基团。作为实例，共轭二烯基团可以为四嗪(例如，1,2,3,4
‑
四嗪和/或1,2,4,5
‑
四嗪)基团。
[0138]
当点击化学官能团为亲二烯体基团时，亲二烯体基团可以为烯烃基团和环烷烃基团，并且环烷烃基团包含双环或稠环结构。作为实例，亲二烯体基团可以为降冰片烯基团。
[0139]
r”'为取代或未取代的c1‑
20
亚烷基、取代或未取代的c2‑
20
亚烯基、取代或未取代的
c1‑
10
亚炔基、取代或未取代的c1‑
10
聚亚甲基、取代或未取代的c5‑
12
芳基、取代或未取代的c5‑
14
芳基亚烷基、取代或未取代的c8‑
16
芳基亚烯基、取代或未取代的c3‑
10
环亚烷基、取代或未取代的c3‑
10
杂环亚烷基或者取代或未取代的c5‑
12
杂芳基，并且杂亚烷基、杂环亚烷基或杂芳基包含n、o或s中的至少一种或多种，以及
[0140]
所述取代为非氢取代基取代，所述非氢取代基是选自于由
‑
ra、
‑
o
‑
、＝o、
‑
ora、
‑
sra、
‑
s
‑
、
‑
n(ra)2、＝nra、
‑
c(rb)3、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
nv、
‑
nhc(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝o)nrara、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2ra、
‑
os(＝o)2ora、
‑
s(＝o)2nra、
‑
s(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、亚烷基
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝s)ra、
‑
c(＝o)ora、亚烷基
‑
c(＝o)ora、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)ora、
‑
c(＝o)sra、
‑
c(＝s)sra、
‑
c(＝o)nrara、亚烷基
‑
c(＝o)nrara、
‑
c(＝s)nrara、
‑
c(
‑
nra)nrara、和rb组成的组的任一种或多种，
[0141]
ra为h、c1‑6烷基、c5‑
12
芳基、c7‑
12
芳烷基或杂环基团，
[0142]
rb为f、cl、br或i，
[0143]
x为o、n或s。
[0144]
在式2中，
[0145]
r'为酯基活化部分。酯基活化部分包括n
‑
羟基琥珀酰亚胺基(nhs)、对硝基苯基和五氟苯基，但不限于此。此外，r'可以为r'可以为的任一种。
[0146]
r”为点击化学官能团中的任一种，并且
[0147]
点击化学官能团可以为炔烃、环辛炔和环壬炔(例如环炔烃，如双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体中的任一种或多种基团，但不限于此。
[0148]
当点击化学官能团是环炔烃基团时，环炔烃基团可以为环辛炔、环壬炔、二苯并环辛炔(dibo)、barac(二芳基氮杂环辛炔酮)、alo(无芳基辛炔)、difo(二氟化环辛炔)、mofo(单氟化环辛炔)、dibac(二苯并氮杂环辛炔)和dimac(二甲氧基氮杂环辛炔)中的任一种基团，但不限于此。
[0149]
当点击化学官能团为共轭二烯基团时，共轭二烯基团可以为烯烃基团和环烷烃基团。作为实例，共轭二烯基团可以为四嗪(例如，1,2,3,4
‑
四嗪和/或1,2,4,5
‑
四嗪)基团。
[0150]
当点击化学官能团为亲二烯体基团时，亲二烯体可以为烯烃基团和环烷烃基团，并且环烷烃基团包含双环或稠环结构。作为实例，亲二烯体基团可以为反式环辛烯(tco)基团或降冰片烯基团。
[0151]
r”'为取代或未取代的c1‑
20
亚烷基、取代或未取代的c2‑
20
亚烯基、取代或未取代的c1‑
10
亚炔基、取代或未取代的c1‑
10
聚亚甲基、取代或未取代的c5‑
12
芳基、取代或未取代的c5‑
14
芳基亚烷基、取代或未取代的c8‑
16
芳基亚烯基、取代或未取代的c3‑
10
环亚烷基、取代或未取代的c3‑
10
杂环亚烷基或者取代或未取代的c5‑
12
杂芳基，并且杂亚烷基、杂环亚烷基或杂芳基包含n、o或s中的至少一种或多种，以及
[0152]
所述取代为非氢取代基取代，所述非氢取代基是选自于由
‑
ra、
‑
o
‑
、＝o、
‑
ora、
‑
sra、
‑
s
‑
、
‑
n(ra)2、＝nra、
‑
c(rb)3、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
n3、
‑
nhc(＝o)
ra、
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝o)nrara、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2ra、
‑
os(＝o)2ora、
‑
s(＝o)2nra、
‑
s(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、亚烷基
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝s)ra、
‑
c(＝o)ora、亚烷基
‑
c(＝o)ora、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)ora、
‑
c(＝o)sra、
‑
c(＝s)sra、
‑
c(＝o)nrara、亚烷基
‑
c(＝o)nrara、
‑
c(＝s)nrara、
‑
c(
‑
nra)nrara、和rb组成的组中的任一种或多种，
[0153]
ra为h、c1‑6烷基、c5‑
12
芳基、c7‑
12
芳烷基或杂环基团，
[0154]
rb为f、cl、br或i，
[0155]
x为o、n或s。
[0156]
在本发明的式中，用于表示作为部分或取代基与核或骨架结构的连接点的键。
[0157]
根据本说明书中公开的示例性实施方式，由式1表示的化合物可以为反式化合物。
[0158]
当式1与以下相同时，式1用下式1
‑
1表示：
[0159]
r'为
[0160]
r”为点击化学官能团中的任一种，并且
[0161]
点击化学官能团可以为炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体(例如烯烃)中的任一种或多种基团，在此情况下，环炔烃、共轭二烯和二烯与上述那些相同。
[0162]
r”'为取代或未取代的c1‑
20
亚烷基、取代或未取代的c1‑
20
杂亚烷基、取代或未取代的c1‑
20
卤代烷基或c1‑
10
聚亚甲基，并且杂亚烷基包含选自于由n、o和s组成的组的至少一种或多种，
[0163]
所述取代为非氢取代基取代，所述非氢取代基是选自于由
‑
ra、
‑
o
‑
、＝o、
‑
ora、
‑
sra、
‑
s
‑
、
‑
n(ra)2、＝nra、
‑
c(rb)3、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
n3、
‑
nhc(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝o)nrara、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2ra、
‑
os(＝o)2ora、
‑
s(＝o)2nra、
‑
s(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、亚烷基
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝s)ra、
‑
c(＝o)ora、亚烷基
‑
c(＝o)ora、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)ora、
‑
c(＝o)sra、
‑
c(＝s)sra、
‑
c(＝o)nrara、亚烷基
‑
c(＝o)nrara、
‑
c(＝s)nrara、
‑
c(
‑
nra)nrara、和rb组成的组中的任一种或多种，
[0164]
ra为h、c1‑6烷基、c5‑
12
芳基、c7‑
12
芳烷基或杂环基团，
[0165]
rb为f、cl、br或i，
[0166]
以及x为o、n和s中的任一种。
[0167]
[式1
‑
1]
[0168]
[0169]
具体而言，r”'为中的一种，
[0170]
r1为h，
[0171]
r2为h或c(＝o)，
[0172]
r3为h或c(＝o)，
[0173]
r4为h或c(＝o)，
[0174]
r5为h或c(＝o)，
[0175]
r6为h或c(＝o)，
[0176]
y1可以为c、n、o和s中的任一种，并且
[0177]
n可以为1至20的整数中的任一个，但不限于此。
[0178]
r5和r6不能同时为c(＝o)，并且
[0179]
当y1为n、o和s中的任一种时，r4、r5和r6可以不是c(＝o)。
[0180]
更具体而言，r”'为
[0181]
r4为h或c(＝o)，
[0182]
r5为h或c(＝o)，
[0183]
r6为h或c(＝o)，
[0184]
y1可以为c、n、o和s中的任一种，并且
[0185]
n可以为1至10的整数中的任一个。
[0186]
在示例性的实施方式中，当式1
‑
1与以下相同时，式1
‑
1由以下式1
‑1‑
1表示：
[0187]
r'为
[0188]
r”为点击化学官能团的任一种，
[0189]
r”'为
[0190]
n为1，
[0191]
r4为h或c(＝o)，
[0192]
r5为h或c(＝o)，
[0193]
r6为h或c(＝o)，
[0194]
y1为c，
[0195]
以及x为n、o和s中的任一种。
[0196]
[式1
‑1‑
1]
[0197][0198]
在另一示例性的实施方式中，当式1
‑
1与以下相同时，式1
‑
1由以下式1
‑1‑
2表示：
[0199]
r'为
[0200]
r”为降冰片烯基团，
[0201]
r”'为
[0202]
r4为h，
[0203]
r5为h，
[0204]
r6为h，
[0205]
n为1，
[0206]
y1为c，
[0207]
以及x为o。
[0208]
[式1
‑1‑
2]
[0209][0210]
作为另一示例性的实施方式，可由式1表示的化合物可为下表1中所述的化合物。
[0211]
[表1]
[0212]
[0213][0214]
当式1与以下相同时，式1由以下式1
‑
2表示：
[0215]
r'为
[0216]
r”为点击化学官能团中的任一种，
[0217]
点击化学官能团可以为炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体(例如烯烃)中的任一种或多种基团，在此情况下，环炔烃基团、共轭二烯基团和二烯基团与上述那些相同。
[0218]
r”'为取代或未取代的c1‑
20
亚烷基、取代或未取代的c1‑
20
杂亚烷基、取代或未取代的c1‑
20
卤代烷基或c1‑
10
聚亚甲基，并且杂亚烷基包含选自于由n、o和s组成的组的至少一种或多种，
[0219]
所述取代为非氢取代基取代，所述非氢取代基是选自于由
‑
ra、
‑
o
‑
、＝o、
‑
ora、
‑
sra、
‑
s
‑
、
‑
n(ra)2、＝nra、
‑
c(rb)3、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
n3、
‑
nhc(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝o)nrara、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2ra、
‑
os(＝o)2ora、
‑
s(＝o)2nra、
‑
s(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、亚烷基
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝s)ra、
‑
c(＝o)ora、亚烷基
‑
c(＝o)ora、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)ora、
‑
c(＝o)sra、
‑
c(＝s)sra、
‑
c(＝o)nrara、亚烷基
‑
c(＝o)nrara、
‑
c(＝s)nrara、
‑
c(
‑
nra)nrara、和rb组成的组中的任一种或多种，
[0220]
ra为h、c1‑6烷基、c5‑
12
芳基、c7‑
12
芳烷基或杂环基团，
[0221]
rb为f、cl、br或i，
[0222]
以及x为o、n和s中的任一种。
[0223]
[式1
‑
2]
[0224][0225]
具体而言，r”'为中的一种，
[0226]
r1为h，
[0227]
r2为h或c(＝o)，
[0228]
r3为h或c(＝o)，
[0229]
r4为h或c(＝o)，
[0230]
r5为h或c(＝o)，
[0231]
r6为h或c(＝o)，
[0232]
y1可以为c、n、o和s中的任一种，并且
[0233]
n可以为1至20的整数中的任一个，但不限于此。
[0234]
在此情况下，r5和r6不能同时为c(＝o)，并且
[0235]
当y1是n、o和s中的任一种时，r4、r5和r6可以不是c(＝o)。
[0236]
更具体而言，r”'为
[0237]
r4为h或c(＝o)，
[0238]
r5为h或c(＝o)，
[0239]
r6为h或c(＝o)，
[0240]
y1可以为c、n、o和s中的任一种，并且
[0241]
n可以为1至10的整数中的任一个。
[0242]
在示例性的实施方式中，当式1
‑
2与以下相同时，式1
‑
2由以下式1
‑2‑
1表示：
[0243]
r”'为
[0244]
r”为点击化学官能团的任一种，
[0245]
n为1，
[0246]
r4为h或c(＝o)，
[0247]
r5为h或c(＝o)，
[0248]
r6为h或c(＝o)，
[0249]
y1为c，
[0250]
以及x为n、o和s中的任一种。
[0251]
[式1
‑2‑
1]
[0252][0253]
在另一示例性的实施方式中，当式1
‑
2与以下相同时，式1
‑
2由以下式1
‑2‑
2表示：
[0254]
r'为
[0255]
r”为降冰片烯基团，
[0256]
r”'为
[0257]
r4为h，
[0258]
r5为h，
[0259]
r6为h，
[0260]
n为1，
[0261]
y1为c，
[0262]
以及x为o。
[0263]
[式1
‑2‑
2]
[0264][0265]
作为示例性的实施方式，可由式1表示的化合物可为下表2中所述的化合物。
[0266]
[表2]
[0267]
[0268][0269]
根据本说明书中公开的示例性的实施方式，由式2表示的化合物可以为顺式化合物。
[0270]
当式2与以下相同时，式2由以下式2
‑
1表示：
[0271]
r'为
[0272]
r”为点击化学官能团中的任一种，
[0273]
点击化学官能团可以为炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体(例如烯烃)中的任一种或多种基团，在此情况下，环炔烃基团、共轭二烯基团和二烯基团与上述那些相同。
[0274]
r”'为取代或未取代的c1‑
20
亚烷基、取代或未取代的c1‑
20
杂亚烷基、取代或未取代的c1‑
20
卤代烷基或c1‑
10
聚亚甲基，并且杂亚烷基包含选自于由n、o和s组成的组的至少一种或多种，
[0275]
所述取代为非氢取代基取代，所述非氢取代基是选自于由
‑
ra、
‑
o
‑
、＝o、
‑
ora、
‑
sra、
‑
s
‑
、
‑
n(ra)2、＝nra、
‑
c(rb)3、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
n3、
‑
nhc(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝o)nrara、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2ra、
‑
os(＝o)2ora、
‑
s(＝o)2nra、
‑
s(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、亚烷基
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝s)ra、
‑
c(＝o)ora、亚烷基
‑
c(＝o)ora、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)ora、
‑
c(＝o)sra、
‑
c(＝s)sra、
‑
c(＝o)nrara、亚烷基
‑
c(＝o)nrara、
‑
c(＝s)nrara、
‑
c(
‑
nra)nrara、和rb组成的组中的任一种或多种，
[0276]
ra为h、c1‑6烷基、c5‑
12
芳基、c7‑
12
芳烷基或杂环基团，
[0277]
rb为f、cl、br或i，
[0278]
以及x为o、n和s中的任一种。
[0279]
[式2
‑
1]
[0280][0281]
具体而言，r”'为之一，
[0282]
r7为h，
[0283]
r8为h或c(＝o)，
[0284]
r9为h或c(＝o)，
[0285]
r
10
为h或c(＝o)，
[0286]
r
11
为h或c(＝o)，
[0287]
r
12
为h或c(＝o)，
[0288]
y2可以为c、n、o和s中的任一种，并且
[0289]
n可以为1至20的整数中的任一个，但不限于此。
[0290]
在此情况下，r
11
和r
12
不能同时为c(＝o)，并且
[0291]
当y2为n、o和s中的任一种时，r
10
、r
11
和r
12
可以不是c(＝o)。
[0292]
更具体而言，r”'为
[0293]
r
10
为h或c(＝o)，
[0294]
r
11
为h或c(＝o)，
[0295]
r
12
为h或c(＝o)，
[0296]
y2可以为c、n、o和s中的任一种，并且
[0297]
n可以为1至10的整数中的任一个。
[0298]
在示例性的实施方式中，当式2
‑
1与以下相同时，式2
‑
1由以下式2
‑1‑
1表示：
[0299]
r'为
[0300]
r”为点击化学官能团的任一种，
[0301]
r”'为
[0302]
n为1，
[0303]
r
10
为h或c(＝o)，
[0304]
r
11
为h或c(＝o)，
[0305]
r
12
为h或c(＝o)，
[0306]
y2为c，
[0307]
以及x为n、o和s中的任一种。
[0308]
[式2
‑1‑
1]
[0309][0310]
在另一示例性的实施方式中，当式2
‑
1与以下相同时，式2
‑
1由以下式2
‑1‑
2表示：
[0311]
r'为
[0312]
r”为降冰片烯基团，
[0313]
r”'为
[0314]
n为1，
[0315]
r
10
为h，
[0316]
r
11
为h，
[0317]
r
12
为h，
[0318]
y2为c，
[0319]
n为1，以及
[0320]
x为o。
[0321]
[式2
‑1‑
2]
[0322][0323]
作为一个示例性的实施方式，可由式2表示的化合物可为下表3中所述的化合物。
[0324]
[表3]
[0325]
[0326]
[0327]
[0328][0329]
当式2与以下相同时，式2由以下式2
‑
2表示：
[0330]
r'为
[0331]
r”为点击化学官能团中的任一种，
[0332]
点击化学官能团可以为炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体(例如烯烃)中的任一种或多种基团，在此情况下，环炔烃基团、共轭二烯基团和二烯基团与上述那些相同。
[0333]
r”'是取代或未取代的c1‑
20
亚烷基、取代或未取代的c1‑
20
杂亚烷基、取代或未取代的c1‑
20
卤代烷基或c1‑
10
聚亚甲基，并且杂亚烷基包含选自于由n、o和s组成的组的至少一种或多种，
[0334]
所述取代为非氢取代基取代，所述非氢取代基是选自于由
‑
ra、
‑
o
‑
、＝o、
‑
ora、
‑
sra、
‑
s
‑
、
‑
n(ra)2、＝nra、
‑
c(rb)3、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
n3、
‑
nhc(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝o)nrara、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2ra、
‑
os(＝o)2ora、
‑
s(＝o)2nra、
‑
s(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、亚烷基
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝s)ra、
‑
c(＝o)ora、亚烷基
‑
c(＝o)ora、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)ora、
‑
c(＝o)sra、
‑
c(＝s)sra、
‑
c(＝o)nrara、亚烷基
‑
c(＝o)nrara、
‑
c(＝s)nrara、
‑
c(
‑
nra)nrara、和rb组成的组中的任一种或多种，
[0335]
ra为h、c1‑6烷基、c5‑
12
芳基、c7‑
12
芳烷基或杂环基团，
[0336]
rb为f、cl、br或i，
[0337]
以及x为o、n和s中的任一种。
[0338]
[式2
‑
2]
[0339][0340]
具体而言，r”'为中的一种，
[0341]
r7为h，
[0342]
r8为h或c(＝o)，
[0343]
r9为h或c(＝o)，
[0344]
r
10
为h或c(＝o)，
[0345]
r
11
为h或c(＝o)，
[0346]
r
12
为h或c(＝o)，
[0347]
y2可以为c、n、o和s中的任一种，并且
[0348]
n可以为1至20的整数中的任一个，但不限于此。
[0349]
在此情况下，r
11
和r
12
不能同时为c(＝o)，并且
[0350]
当y2是n、o和s中的任一种时，r
10
、r
11
和r
12
可以不是c(＝o)。
[0351]
更具体而言，r”'为
[0352]
r
10
为h或c(＝o)，
[0353]
r
11
为h或c(＝o)，
[0354]
r
12
为h或c(＝o)，
[0355]
y2可以为c、n、o和s中的任一种，并且
[0356]
n可以为1至10的整数中的任一个。
[0357]
在示例性的实施方式中，当式2
‑
2与以下相同时，式2
‑
2由以下式2
‑2‑
1表示：
[0358]
r'为
[0359]
r”为点击化学官能团的任一种，
[0360]
r”'为
[0361]
n为1，
[0362]
r
10
为h或c(＝o)，
[0363]
r
11
为h或c(＝o)，
[0364]
r
12
为h或c(＝o)，
[0365]
y2为c，
[0366]
以及x为n、o和s中的任一种。
[0367]
[式2
‑2‑
1]
[0368][0369]
在另一个示例性的实施方式中，当式2
‑
2与以下相同时，式2
‑
2由以下式2
‑2‑
2表示：
[0370]
r'为
[0371]
r”为降冰片烯基团，
[0372]
r”'为
[0373]
n为1，
[0374]
r
10
为h，
[0375]
r
11
为h，
[0376]
r
12
为h，
[0377]
y2为c，以及
[0378]
x为o。
[0379]
[式2
‑2‑
2]
[0380][0381]
作为示例性的实施方式，可由式2表示的化合物可为下表4中所述的化合物。
[0382]
[表4]
[0383]
[0384]
[0385][0386]
在下文中，当目标分子是抗体时，将对使用上述接头制备抗体
‑
载荷部分偶联物的方法进行描述。制备抗体
‑
载荷部分偶联物的方法，所述方法包括：(1)通过使接头与fc结合肽反应制备接头
‑
fc结合肽偶联物；(2)使接头
‑
fc结合肽偶联物与抗体反应以获得包含第一点击化学官能团的抗体，以及(3)通过使包含第一点击化学官能团的抗体与包含与第一点击化学官能团互补的第二点击化学官能团的载荷部分反应来制备抗体
‑
载荷部分偶联物。在下文中，将分别描述每个过程。
[0387]
制备抗体
‑
载荷部分偶联物的方法可包括：(1)通过使接头与fc结合肽反应来制备接头
‑
fc结合肽偶联物。
[0388]
fc结合肽统称为具有结合到抗体的fc结构域的特性的肽。作为fc结合肽的代表性实例，由delano等人发现的已知具有结合到fcrn结构域的特性的13
‑
mer肽是公知的。本发明的发明人发明了seq id nos:1至5的fc结合肽，其中13
‑
mer肽的特定残基被取代，并且使fc结合肽能够与接头反应。从以下结构可以看出，seq id nos:1至5的fc结合肽可以通过残基6中包含的游离胺基团与接头反应。
[0389]
seq id no:1的fc结合肽是由式13表示的肽：
[0390]
[式13]
[0391]
d
‑
c
‑
a
‑
w
‑
h
‑
xa
‑
g
‑
e
‑
l
‑
v
‑
w
‑
c
‑
t(seq id no:1)
[0392]
其中，d为天冬氨酸，c为半胱氨酸，a为丙氨酸，w为色氨酸，h为组氨酸，xa为
g为甘氨酸，e为谷氨酸，l为亮氨酸，v为缬氨酸，以及t为苏氨酸。在此情况下，m是1以上且4以下的整数，处于n
‑
端的半胱氨酸和处于c
‑
端的半胱氨酸可以彼此选择性地连接。当m＝1(seq id no:3)时，xa为2,3
‑
二氨基丙酸(dap)；当m＝2(seq id no:4)时，xa为2,4
‑
二氨基丁酸(dab)；当m＝3(seq id no:5)时，xa为鸟氨酸；以及当m＝4(seq id no:2)时，xa为赖氨酸。
[0393]
seq id no:2的fc结合肽是由式14表示的肽：
[0394]
[式14]
[0395]
d
‑
c
‑
a
‑
w
‑
h
‑
k
‑
g
‑
e
‑
l
‑
v
‑
w
‑
c
‑
t(seq id no:2)
[0396]
其中，d为天冬氨酸，c为半胱氨酸，a为丙氨酸，w为色氨酸，h为组氨酸，k为赖氨酸，g为甘氨酸，e为谷氨酸，l为亮氨酸，v为缬氨酸，t为苏氨酸，并且处于n
‑
端的半胱氨酸和处于c
‑
端的半胱氨酸可以彼此选择性地连接。
[0397]
接头包括化学式1或化学式2所述的化合物及其具体实例。
[0398]
接头和fc结合肽可通过亲核取代反应结合。其中，当存在于fc结合肽中的亲核原子进攻接头的正电荷或部分正电荷的原子时，可发生亲核取代反应。其中，亲核原子可以为赖氨酸的氮原子。此外，正电荷或部分正电荷的原子可以为羰基的亲电碳。
[0399]
在下文中，示出了由本说明书示例性公开的式1和/或式2表示的化合物，即接头结合到fc结合肽以形成接头
‑
fc结合肽偶联物。
[0400]
例如，接头
‑
fc结合肽偶联物可具有式3的结构。
[0401]
[式3]
[0402][0403]
在式3中，
[0404]
r”为点击化学官能团中的任一种，
[0405]
点击化学官能团可以为炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体中的任一种或多种基团，在此情况下，环炔烃基团、共轭二烯基团和二烯基团与上述那些相同。
[0406]
r”'为取代或未取代的c1‑
20
亚烷基、取代或未取代的c2‑
20
亚烯基、取代或未取代的c1‑
10
亚炔基、取代或未取代的c1‑
10
聚亚甲基、取代或未取代的c5‑
12
芳基、取代或未取代的c5‑
14
芳基亚烷基、取代或未取代的c8‑
16
芳基亚烯基、取代或未取代的c3‑
10
环亚烷基、取代或未取代的c3‑
10
杂环亚烷基或者取代或未取代的c5‑
12
杂芳基，并且杂亚烷基、杂环亚烷基或杂芳基包含n、o或s中的至少一种或多种，以及
[0407]
所述取代为非氢取代基取代，所述非氢取代基是选自于由
‑
ra、
‑
o
‑
、＝o、
‑
ora、
‑
sra、
‑
s
‑
、
‑
n(ra)2、＝nra、
‑
c(rb)3、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
n3、
‑
nhc(＝o)
ra、
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝o)nrara、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2ra、
‑
os(＝o)2ora、
‑
s(＝o)2nra、
‑
s(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、亚烷基
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝s)ra、
‑
c(＝o)ora、亚烷基
‑
c(＝o)ora、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)ora、
‑
c(＝o)sra、
‑
c(＝s)sra、
‑
c(＝o)nrara、亚烷基
‑
c(＝o)nrara、
‑
c(＝s)nrara、
‑
c(
‑
nra)nrara、和rb组成的组中的任一种或多种，
[0408]
ra为h、c1‑6烷基、c5‑
12
芳基、c7‑
12
芳烷基或杂环基团，
[0409]
rb为f、cl、br或i，
[0410]
x可以为o、n或s。
[0411]
y3可以为o、n和s中的任一种。
[0412]
fp是fc结合肽。此外，fp可为选自式13或式14的任一种肽。关于式13和式14的详细内容与已描述的那些相同。
[0413]
fp可通过y3在氨基酸残基6处连接。在此情况下，氨基酸残基6可为赖氨酸、鸟氨酸、2,3
‑
二氨基丙酸或2,4
‑
二氨基丁酸。
[0414]
作为实例，式3所示的化合物可由反应方案1制备。
[0415]
[反应方案1]
[0416][0417]
反应方案1是通过使式1所示的化合物与包含1至50个氨基酸的fc结合肽反应来生成式3所示化合物的反应。
[0418]
fc结合肽与式1之间的结合反应可通过取代反应进行。
[0419]
取代反应可以为亲核酰基取代反应。
[0420]
取代反应可通过式1的化合物与fc结合肽的胺基(
‑
nh2)、巯基(
‑
sh)和羟基(
‑
oh)中任一个之间的反应来进行。
[0421]
作为实例，当式1的化合物与fc结合肽的胺基(
‑
nh2)反应时，y3可为n(h)。由于seq id nos:1至5的肽在残基6处包含2,3
‑
二氨基丙酸、2,4
‑
二氨基丁酸、鸟氨酸或赖氨酸，因此所有相应残基包含游离胺基以便可以进行取代反应。
[0422]
作为另一实例，当式1的化合物与fc结合肽的巯基(
‑
sh)反应时，y3可为s。
[0423]
作为实例，当式1的化合物与fc结合肽的任一个羟基(
‑
oh)反应时，y3可为o。
[0424]
例如，接头
‑
fc结合肽偶联物可具有式4的结构。
[0425]
[式4]
[0426][0427]
在式4中，
[0428]
r”为点击化学官能团中的任一种，
[0429]
点击化学官能团可以为炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体中的任一种或多种基团，其中，环炔烃基团、共轭二烯基团和二烯基团与上述那些相同。
[0430]
r”'为取代或未取代的c1‑
20
亚烷基、取代或未取代的c2‑
20
亚烯基、取代或未取代的c1‑
10
亚炔基、取代或未取代的c1‑
10
聚亚甲基、取代或未取代的c5‑
12
芳基、取代或未取代的c5‑
14
芳基亚烷基、取代或未取代的c8‑
16
芳基亚烯基、取代或未取代的c3‑
10
环亚烷基、取代或未取代的c3‑
10
杂环亚烷基或者取代或未取代的c5‑
12
杂芳基，并且杂亚烷基、杂环亚烷基或杂芳基包含n、o或s中的至少一种或多种，以及
[0431]
所述取代为非氢取代基取代，所述非氢取代基是选自于由
‑
ra、
‑
o
‑
、＝o、
‑
ora、
‑
sra、
‑
s
‑
、
‑
n(ra)2、＝nra、
‑
c(rb)3、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
n3、
‑
nhc(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝o)nrara、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2ra、
‑
os(＝o)2ora、
‑
s(＝o)2nra、
‑
s(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、亚烷基
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝s)ra、
‑
c(＝o)ora、亚烷基
‑
c(＝o)ora、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)ora、
‑
c(＝o)sra、
‑
c(＝s)sra、
‑
c(＝o)nrara、亚烷基
‑
c(＝o)nrara、
‑
c(＝s)nrara、
‑
c(
‑
nra)nrara、和rb组成的组中的任一种或多种，
[0432]
ra为h、c1‑6烷基、c5‑
12
芳基、c7‑
12
芳烷基或杂环基团，
[0433]
rb为f、cl、br或i，
[0434]
x可以为o、n或s。
[0435]
y4可以为o、n和s中的任一种。
[0436]
fp是fc结合肽。此外，fp可为选自式13或式14的任一种肽。关于式13和式14的详细内容与已描述的那些相同。
[0437]
fp可通过y4在氨基酸残基6处连接。在此情况下，氨基酸残基6可为赖氨酸、鸟氨酸、2,3
‑
二氨基丙酸或2,4
‑
二氨基丁酸。
[0438]
作为实例，式4所示的化合物可由反应方案2制备。
[0439]
[反应方案2]
[0440][0441]
反应方案2是通过使式2所示的化合物与包含1至50个氨基酸的fc结合肽反应来生成式4所示的化合物的反应。
[0442]
fc结合肽与式2之间的结合反应可通过取代反应进行。
[0443]
取代反应可以为亲核酰基取代反应。
[0444]
取代反应可通过式2的化合物与fc结合肽的胺基(
‑
nh2)、巯基(
‑
sh)和羟基(
‑
oh)中任一个之间的反应来进行。
[0445]
作为实例，当式2的化合物与fc结合肽的胺基(
‑
nh2)反应时，y4可为n。由于seq id nos:1至5的肽在残基6处包含2,3
‑
二氨基丙酸、2,4
‑
二氨基丁酸、鸟氨酸或赖氨酸，因此所
有相应残基包含游离胺基以便可以进行取代反应。
[0446]
作为另一实例，当式2的化合物与fc结合肽的巯基(
‑
sh)反应时，y4可为s。
[0447]
作为实例，当式2的化合物与fc结合肽的任一个羟基(
‑
oh)反应时，y4可为o。
[0448]
在反应方案1和反应方案2中，式3和/或式4所示的化合物可通过使fc结合肽的胺基(
‑
nh2)、巯基(
‑
sh)和羟基(
‑
oh)残基与第一羰基的碳原子反应而制备。
[0449]
在此情况下，与r'最紧密相连的羰基碳(即第一羰基的亲电碳原子)可具有最大的部分正电荷(δ )。
[0450]
制备抗体
‑
载荷部分偶联物的方法可包括(2)使接头
‑
fc结合肽与抗体反应以获得包含第一点击化学官能团的抗体。
[0451]
此外，在此情况下，当fc结合肽对fc结构域的特定位点具有亲和力时，可诱导接头
‑
fc结合肽偶联物与抗体的特定位点反应。本发明的发明人开发了一种技术，其能够将第一点击化学官能团转移到抗体的特定位点，特别是，fc的赖氨酸246(fc
‑
lys246)或赖氨酸248(fc
‑
lys248)的位置，使用对抗体的fcrn结构域具有亲和力的seq id nos:1至5的fc结合肽。
[0452]
接头
‑
fc结合肽偶联物与抗体之间的反应可以为亲核取代反应。在此情况下，当抗体中存在的亲核原子进攻接头
‑
fc结合肽偶联物的正电荷或部分正电荷原子时，亲核取代反应可以发生。在此情况下，亲核原子可以为赖氨酸的氮原子。此外，正电荷或部分正电荷的原子可以为包含在接头结构中的羰基的亲电碳。
[0453]
在一个实例中，包含第一点击化学官能团的抗体可由式5表示。
[0454]
[式5]
[0455][0456]
在式5中，
[0457]
ab为抗体。在特定的实施方式中，ab可为曲妥珠单抗(trastuzumab)。
[0458]
r”为点击化学官能团中的任一种，
[0459]
点击化学官能团可以为炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体中的任一种或多种基团，并且在此情况下，环炔烃基团、共轭二烯基团和二烯基团与上述那些相同。
[0460]
此外，连接到ab的氮原子可包含在抗体的fc的246位赖氨酸或248位赖氨酸中。在特定的实施方式中，连接到ab的氮可包含在抗体的fc的赖氨酸246中。在特定的实施方式中，连接到ab的氮原子可包含在抗体的fc的赖氨酸248中。
[0461]
n为1以上且4以下的整数。例如，n可以为2。在此情况下，r”可以连接至246位赖氨酸或248位赖氨酸，其分别包含在一个抗体中的两个fc中，以产生这样的结构。在另一实例中，n可为4。在此情况下，r”可连接至赖氨酸246和赖氨酸248，其分别包含在一个抗体中的两个fc中，以产生这样的结构。
[0462]
n为2，连接到ab的氮原子可以包含在抗体的两个fc的赖氨酸246中。或者，n为2，并且连接到ab的氮原子可以包含在抗体的两个fc的赖氨酸248中。
[0463]
式5的抗体可由以下反应方案3所表示的反应制备。
[0464]
[反应方案3]
[0465][0466]
在此情况下，关于式3和式5的详细内容与已描述的那些相同。
[0467]
在此情况下，由于seq id nos:1至5的肽在残基6处分别包含2,3
‑
二氨基丙酸、2,4
‑
二氨基丁酸、鸟氨酸或赖氨酸，因此所有相应残基仅在含有游离胺基的碳骨架的长度上有差异，并且具有类似的结构。因此，seq id nos:1至5的所有肽显示出结合到抗体的fc结构域的特性。
[0468]
在另一实例中，包含第一点击化学官能团的抗体可由式6表示。
[0469]
[式6]
[0470][0471]
在式6中，
[0472]
ab为抗体。在特定的实施方式中，ab可为曲妥珠单抗。
[0473]
r”'为取代或未取代的c1‑
20
亚烷基、取代或未取代的c2‑
20
亚烯基、取代或未取代的c1‑
10
亚炔基、取代或未取代的c1‑
10
聚亚甲基、取代或未取代的c5‑
12
芳基、取代或未取代的c5‑
14
芳基亚烷基、取代或未取代的c8‑
16
芳基亚烯基、取代或未取代的c3‑
10
环亚烷基、取代或未取代的c3‑
10
杂环亚烷基或者取代或未取代的c5‑
12
杂芳基，并且杂亚烷基、杂环亚烷基或杂芳基包含n、o或s中的至少一种或多种，以及
[0474]
所述取代为非氢取代基取代，所述非氢取代基是选自于由
‑
ra、
‑
o
‑
、＝o、
‑
ora、
‑
sra、
‑
s
‑
、
‑
n(ra)2、＝nra、
‑
c(rb)3、
‑
n＝c＝o、
‑
ncs、
‑
no、
‑
no2、＝n
‑
oh、＝n2、
‑
n3、
‑
nhc(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝o)nrara、
‑
s(＝o)2o
‑
、
‑
s(＝o)2oh、
‑
s(＝o)2ra、
‑
os(＝o)2ora、
‑
s(＝o)2nra、
‑
s(＝o)ra、
‑
c(＝o)ra、亚烷基
‑
c(＝o)ra、
‑
c(＝s)ra、
‑
c(＝o)ora、亚烷基
‑
c(＝o)ora、
‑
c(＝o)o
‑
、亚烷基
‑
c(＝o)o
‑
、
‑
c(＝s)ora、
‑
c(＝o)sra、
‑
c(＝s)sra、
‑
c(＝o)nrara、亚烷基
‑
c(＝o)nrara、
‑
c(＝s)nrara、
‑
c(
‑
nra)nrara、和rb组成的组中的任一种或多种。
[0475]
此外，连接到ab的氮原子可包含在抗体的fc的246位赖氨酸或248位赖氨酸中。在特定的实施方式中，连接到ab的氮可包含在抗体的fc的赖氨酸246中。在特定的实施方式中，连接到ab的氮原子可包含在抗体的fc的赖氨酸248中。
[0476]
进一步地，在此情况下，fc结合肽可包含第一点击化学官能团。点击化学官能团可以为炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体中的任一种或多种基团，并且在此情况下，环炔烃基团、共轭二烯基团和二烯基团与上述那些相同。此外，fc结合肽可在其序列的n
‑
端附近的氨基酸残基处包含第一点击化学基团。此外，fc结合肽可在其序列的n
‑
端处包
含第一点击化学基团。或者，fc结合肽可在其序列的c
‑
端附近的氨基酸残基处包含第一点击化学官能团。此外，fc结合肽可在其序列的c
‑
端处包含第一点击化学官能团。
[0477]
fp是fc结合肽。此外，fp可为选自式13或式14的任一种肽。关于式13和式14的详细内容与已描述的那些相同。
[0478]
fp可通过y3在氨基酸残基6处连接。在此情况下，氨基酸残基6可为赖氨酸、鸟氨酸、2,3
‑
二氨基丙酸或2,4
‑
二氨基丁酸。
[0479]
n为1以上且4以下的整数。例如，n可以为2。在此情况下，fp可以连接至246位赖氨酸或248位赖氨酸，其分别包含在一个抗体中的两个fc中，以产生这样的结构。在另一实例中，n可为4。在此情况下，r”可连接至分别包含在一个抗体中的两个fc中的赖氨酸246和赖氨酸248，以产生这样的结构。
[0480]
n为2，连接到ab的氮原子可以包含在抗体的两个fc的赖氨酸246中。在另一实例中，n为2，并且连接到ab的氮原子可以包含在抗体的两个fc的赖氨酸248中。
[0481]
式6的抗体可由以下反应方案4所表示的反应制备。
[0482]
[反应方案4]
[0483][0484]
在此情况下，关于式4和式6的详细内容与已描述的那些相同。
[0485]
在此情况下，由于seq id nos:1至5的肽在残基6处分别包含2,3
‑
二氨基丙酸、2,4
‑
二氨基丁酸、鸟氨酸或赖氨酸，因此所有相应残基仅在具有游离胺基的碳骨架的长度上有差异，并且具有类似的结构。因此，seq id nos:1至5的所有肽显示出结合到抗体的fc结构域的特性。
[0486]
制备抗体
‑
载荷部分偶联物的方法可包括(3)通过使包含第一点击化学官能团的抗体与包含与第一点击化学官能团互补的第二点击化学官能团的载荷部分反应来制备抗体
‑
载荷部分偶联物。
[0487]
载荷部分可包含活性部分。活性部分可选自核酸、肽和化合物中的一种或多种。活性部分可以为选自于由药物分子、成像部分、光学剂、维生素和毒素组成的组中的任一种。在特定的实施方式中，活性部分可为药物分子。药物分子可以为前药(prodrug)、前体药物(precursor drug)或药物(drug)。药物分子可以为抗癌药物、消炎剂、另一种抗病剂和抗微生物剂(抗菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂)。在特定的实施方式中，药物分子可为美登素(dm1)。在特定的实施方式中，载荷部分可包括两种或多种药物分子。在特定的实施方式中，活性部分可以为成像部分。成像部分可以为造影剂、放射性同位素、荧光物质。在特定的实施方式中，活性部分可为光学剂、维生素、毒素等，但不限于此。
[0488]
此外，载荷部分包含第二点击化学官能团。其中，点击化学官能团为炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体中的任一种或多种基团，并且在此情况下，环炔烃基团、
共轭二烯基团和二烯基团与上述那些相同。
[0489]
在一个实例中，抗体
‑
载荷部分偶联物可由式7表示。
[0490]
[式7]
[0491][0492]
在式7中，
[0493]
ab是抗体。在特定的实施方式中，ab可为曲妥珠单抗。
[0494]
连接到ab的氮原子可包含在抗体的fc的246位赖氨酸或248位赖氨酸中。在特定的实施方式中，连接到ab的氮可包含在抗体的fc的赖氨酸246中。在特定的实施方式中，连接到ab的氮原子可包含在抗体的fc的赖氨酸248中。
[0495]
b可以为由第一点击化学官能团和第二点击化学官能团的点击化学形成的结构中的任一种。例如，b可为选自炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体中的两个反应物生成的结构中的任一种。在特定的实施方式中，b可以为b可以为其中，a1可与抗体连接，a2可与am连接。或者，a1可连接到am，且a2可连接到抗体。
[0496]
am是活性部分或包含该活性部分的结构。在一个实施方式中，am可包括两个或多个活性部分。活性部分的内容与载荷部分的说明中描述的内容相同。
[0497]
n为1以上且4以下的整数。例如，n可以为2。在此情况下，载荷部分可以连接到246位赖氨酸或248位赖氨酸，其包含在一个抗体的两个fc中，以产生这样的结构。在另一实例中，n可为4。在此情况下，r”可连接到分别包含在一个抗体的两个fc中的赖氨酸246和赖氨酸248，以产生这样的结构。
[0498]
n为2，并且连接到ab的氮原子可包含在抗体的两个fc的赖氨酸246中。在另一实施方式中，n为2，并且连接到ab的氮原子可包含在抗体的两个fc的赖氨酸248中。
[0499]
作为一个实例，式7所示的化合物可由反应方案5制备。
[0500]
[反应方案5]
[0501][0502]
在此情况下，r”为第一点击化学官能团，并且与上文描述的式5时描述的相同。
[0503]
此外，r
””
为第二点击化学官能团，并且与描述载荷部分时描述的相同。
[0504]
在一个实例中，抗体
‑
载荷部分偶联物可由式8表示。
[0505]
[式8]
[0506][0507]
在式8中，
[0508]
ab为抗体。在特定的实施方式中，ab可为曲妥珠单抗。
[0509]
连接到ab的氮原子可包含在抗体的246位赖氨酸或248位赖氨酸中。在特定的实施方式中，连接到ab的氮原子可包含在抗体的赖氨酸246中。在特定的实施方式中，连接到ab的氮原子可包含在抗体的赖氨酸248中。
[0510]
b可以为由第一点击化学官能团和第二点击化学官能团的点击化学形成的结构中的任一种。例如，b可为可由选自炔烃、例如环辛炔和环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬
‑4‑
炔
‑9‑
基甲醇)的环炔烃、反式环辛烯、硝酮、氧化腈、叠氮化物、共轭二烯和亲二烯体中的两个反应部分生成的结构中的任一种。在特定的实施方式中，b可以为其中，a1可以连接到抗体，并且a2可以连接到am。或者，a1可以连接到am，并且a2可以连接到抗体。
[0511]
fp为fc结合肽。此外，fp可为选自式13或式14的任一种肽。关于式13和式14的详细内容与已描述的那些相同。
[0512]
fp可通过y4在氨基酸残基6处连接。在此情况下，氨基酸残基6可为赖氨酸、鸟氨酸、2,3
‑
二氨基丙酸或2,4
‑
二氨基丁酸。
[0513]
am是活性部分或含有该活性部分的结构。在特定的实施方式中，am可包括两个或多个活性部分。活性部分的内容与载荷部分的描述中描述的内容相同。
[0514]
b可结合至fc结合肽序列的n
‑
端附近的氨基酸残基。在另一实施方式中，b可结合至fc结合肽的n
‑
端。在另一实施方式中，b可结合至fc结合肽序列的c
‑
端附近的氨基酸残基。在另一实施方式中，b可结合至fc结合肽的c
‑
端。
[0515]
n为1以上且4以下的整数。例如，n可以为2。在此情况下，载荷部分可以连接到246位赖氨酸或248位赖氨酸，其分别包含在一个抗体的两个fc中，以产生这样的结构。在另一实例中，n可为4。在此情况下，载荷部分可连接至分别包含在一个抗体的两个fc中的赖氨酸246和赖氨酸248，以产生这样的结构。
[0516]
n为2，连接到ab的氮原子可包含在抗体的两个fc的赖氨酸246中。或者，n为2，并且连接到ab的氮原子可包含在抗体的两个fc的赖氨酸248中。
[0517]
作为实例，式8所示的化合物可由反应方案6制备。
[0518]
[反应方案6]
[0519][0520]
在此情况下，r
””
'是第一点击化学官能团，并且与以上描述式6时所描述的相同。在合成fc结合肽的过程中，第一点击化学官能团可包含在氨基酸残基中。任一种残基均可用作包含第一点击化学官能团的氨基酸残基，但优选该氨基酸残基不是残基6，这是因为残基6是设计用于与接头的取代反应的残基。通过人工合成肽的过程，fc结合肽可在其序列的n
‑
端附近的氨基酸残基处包含第一点击化学官能团。在特定的实施方式中，fc结合肽可在其序列的n
‑
端处包含第一点击化学基团。在特定的实施方式中，fc结合肽可在其序列的c
‑
端附近的氨基酸残基处包含第一点击化学官能团。在特定的实施方式中，fc结合肽可在其序列的c
‑
端处包含第一点击化学官能团。
[0521]
此外，r
””
为第二点击化学官能团，并且与描述载荷部分时描述的官能团相同。
[0522]
本技术可提供有助于转送和结合反应的接头，使得载荷部分可连接到期望的目标分子。
[0523]
接头或接头部分可直接连接至目标分子。直接连接至目标分子的接头部分可以连接至载荷部分。
[0524]
接头部分可以为接头中的残基的一部分或官能团的一部分。
[0525]
例如，接头部分可以为r”或包含r”的残基的一部分。
[0526]
例如，接头部分可以为不包含r”的接头的残基的一部分。
[0527]
接头部分连接的目标分子可通过点击反应(即点击化学官能团之间的反应)连接到载荷部分，但不限于此。
[0528]
在示例性的实施方式中，当接头具有式1的结构时，连接到目标分子的接头部分可包含点击化学官能团。
[0529]
在此情况下，连接至目标分子的接头部分可与载荷部分一起参与点击反应。
[0530]
这种接头将不会影响目标分子的生物活性。即，接头将对目标分子的半衰期、分泌、血液稳定性等几乎没有影响。
[0531]
目标分子的半衰期可由目标分子的fcrn结合亲和力来决定。例如，目标分子可通过与fcrn结合而在体内再循环，并且半衰期可在体内增加。
[0532]
作为蛋白体凝聚的结果，目标分子的分泌可由目标分子通过肾脏分泌的程度来确定。
[0533]
作为实例，接头可通过连接具有短细胞内半衰期的化合物和蛋白质来增加药物在血液中的半衰期。例如，药物可与具有长细胞内半衰期的目标分子连接。
[0534]
在另一示例性的实施方式中，当接头具有式2的结构时，连接到目标分子的接头部分可以不包含点击化学官能团。
[0535]
连接到目标分子的接头部分可连接到肽、多肽、蛋白质和/或包含点击化学官能团的化合物。
[0536]
肽、多肽、蛋白质和/或化合物可通过点击反应连接到载荷部分。
[0537]
这种接头可能影响目标分子的生物活性。当接头影响目标分子的生物活性时，接头影响目标分子的半衰期、分泌或血液稳定性。例如，当接头间接连接到目标分子时，接头可通过缩短目标分子的半衰期而在体内快速释放载荷部分。
[0538]
接头可连接到对特定目标分子具有结合亲和力的肽或多肽。这样的接头可以将载荷部分以位点特异性的方式连接到目标分子。
[0539]
作为实例，目标分子可以为抗体。
[0540]
例如，抗体可以为igg抗体或igg抗体的部分片段。igg抗体可以为人igg(igg1、igg2、igg3或igg4)和/或兔igg。igg抗体可以为人源性ch2
‑
ch3结构域。目标分子可以为抗体或抗体的部分片段，但不限于此。
[0541]
作为实例，fc结合肽可与抗体具有结合亲和力。
[0542]
例如，fc结合肽可与igg抗体具有结合亲和力。fc结合肽可与igg抗体的特定结构域具有特异性结合亲和力。
[0543]
例如，fc结合肽可对igg抗体的重链或轻链可变区具有特异性。
[0544]
例如，fc结合肽可对igg抗体的重链的恒定结构域具有特异性。在此情况下，重链恒定结构域可以为ch2结构域和/或ch3结构域。
[0545]
fc结合肽可以为与化合物连接的肽或多肽。
[0546]
例如，fc结合肽可包含点击化学官能团。
[0547]
本发明提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予抗体
‑
载荷部分偶联物。在此情况下，癌症可以选自膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、心脏癌、宫颈癌、结直肠癌(colorectal cancer)、直肠癌(rectal cancer)、食管癌、纤维肉瘤、胃癌、胃肠道癌、头颈癌、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤和胸腺癌。此外，癌症可以为乳腺癌。
[0548]
本发明提供了用于治疗癌症的药物组合物，所述组合物包含抗体
‑
载荷部分偶联物。在此情况下，癌症可以选自膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、心脏癌、宫颈癌、结直肠癌、直肠癌、食管癌、纤维肉瘤、胃癌、胃肠道癌、头颈部癌、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤和胸腺癌。此外，癌症可以是乳腺癌。
[0549]
实施例
[0550]
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。
[0551]
提供这些实施例只是为了更具体地描述本发明，并且对于本发明所属领域的普通技术人员来说显而易见的是，本发明的范围不受这些实施例的限制。以下实施例中针对化合物名称给出的编号参照附图书写。
[0552]
[实施例1]化合物i(反式接头：nhs&降冰片烯，式1
‑1‑
2)的合成方法及其结构确认
[0553]
实施例1
‑
1.化合物1的合成及结构确认
[0554]
将10g(68.4mmol，1.0eq)戊二酸单甲酯溶解于250ml二氯甲烷(dcm)中，并搅拌所得溶液。向其缓慢滴加17.7g(92.3mmol，1.34eq)1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edci)和24ml(138mmol，2.0eq)n，n
‑
二异丙基乙胺(dipea)，搅拌所得溶液20分钟，然后向其缓慢滴加8ml(68.7mmol，1.0eq)邻苄基羟胺。18小时后，减压浓缩除去反应溶液，残留物重新溶解在乙酸乙酯(ea)中。有机层用10％柠檬酸溶液洗涤三次，并用饱和盐溶液和硫酸钠干燥。未经纯化在下一步反应中使用目标化合物(粗产率：12.9g，88％)。tlc(ea∶hex＝2∶1)；r
f
＝0.5。
[0555]
1h nmr(300mhz，dmso)δ7.35(d，j＝3.5hz，5h)，4.75(d，j＝3.5hz，2h)，3.56(d，j＝4.0hz，3h)，2.26(td，j＝7.3，3.8hz，2h)，1.96(t，j＝5.6hz，2h)，1.78
‑
1.61(m，2h).
[0556]
实施例1
‑
2化合物2的合成及结构确认
[0557]
将12.9g化合物1溶解于200ml n，n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)中后，在0℃下搅拌所得溶液。向其缓慢滴加24ml(160mmol，3.08eq)1，8
‑
二氮杂双环(5.4.0)十一碳
‑7‑
烯(dbu)和10ml(160mmol，3.08eq)碘甲烷(mei)。向其缓慢滴加0.2ml二乙胺。搅拌所得溶液20小时后，将反应溶剂与硅藻土混合并减压浓缩去除，并且通过柱层析(ea∶hex＝1∶1)纯化目标化合物以获得7.6g(产率：56％)。tlc(ea∶hex＝1∶1)；r
f
＝0.5。
[0558]
1h nmr(300mhz，cdcl3)δ7.44
‑
7.33(m，5h)，4.82(s，2h)，3.65(s，3h)，3.20(s，3h)，2.43(d，j＝7.2hz，2h)，2.34(t，j＝7.3hz，2h)，1.98
‑
1.85(m，2h).
[0559]
实施例1
‑
3化合物3的合成及结构确认
[0560]
将4.18g(15.8mmol，1.0eq)化合物2溶解于100ml四氢呋喃(thf)中后，搅拌所得溶液。在0℃下向其缓慢滴加5ml 2n氢氧化锂(lioh)，然后搅拌所得溶液3小时。通过向其添加60ml h2o终止反应，并且使用150ml ea对水层进行两次洗涤。然后，用2n hcl溶液滴定水层至ph 3.0，并用50ml ea萃取目标化合物三次。使用饱和盐溶液和硫酸钠干燥有机层以获得2.46g(产率：62％)。tlc(ea∶hex＝1∶1)；r
f
＝0.1。
[0561]
1h nmr(300mhz，dmso)δ12.06(s，1h)，7.51
‑
7.29(m，5h)，4.86(s，2h)，3.13(s，3h)，2.38(t，j＝7.3hz，2h)，2.22(dt，j＝11.7，7.4hz，4h).
[0562]
实施例1
‑
4化合物4的合成及结构确认
[0563]
将2.46g化合物3溶解于40ml甲醇(meoh)中后，在碳钯(pd/c)存在下进行氢化反应18小时，终止反应后，通过短程柱除去pd/c，然后纯化并浓缩目标化合物以获得1.2g(产率：76％)。
[0564]
1h nmr(300mhz，dmso)δ12.06(s，1h)，7.51
‑
7.29(m，5h)，4.86(s，2h)，3.13(s，3h)，2.38(t，j＝7.3hz，2h)，2.22(dt，j＝11.7，7.4hz，4h).
[0565]
实施例1
‑
5化合物5的合成及结构确认
[0566]
将0.17g(1.06mmol，1.0eq)化合物4溶解于10ml dcm中，搅拌所得溶液。在0℃下向其缓慢滴加0.22g(1.73mmol，1.63eq)外
‑5‑
降冰片烯酰氯和0.2ml(1.1mmol，1.0eq)dipea。搅拌所得溶液2小时后，使用10％柠檬酸溶液洗涤有机层三次，并使用饱和盐溶液和硫酸钠干燥。未经纯化在下一步反应使用目标化合物(粗产率：0.24g，68％)。tlc(dcm∶meoh＝10∶1)；r
f
＝0.3。
[0567]
预测m.w.(m h) ：282.13g/mol
[0568]
测量m.w.(m h) ：282.1g/mol
[0569]
实施例1
‑
6化合物i的合成及结构确认
[0570]
将0.24g(0.72mmol，1.0eq)化合物5溶解于3ml dcm中，并搅拌所得溶液。向其缓慢滴加0.26g(0.87mmol，1.2eq)n，n，n
′
，n
′‑
四甲基
‑
o
‑
(n
‑
琥珀酰亚胺基)脲四氟硼酸酯(tstu)和0.15ml(0.87mmol，1.2eq)dipea。搅拌所得溶液1小时后，使用10％柠檬酸溶液洗涤有机层三次，并使用饱和盐溶液和硫酸钠干燥。通过柱层析(ea∶hex＝1∶1)纯化目标化合物以获得0.04g(产率：15％)。tlc(ea∶hex＝1∶1)；r
f
＝0.3(参见图1)。
[0571]
1h nmr(300mhz，dmso)δ6.18(ddd，j＝16.9，5.5，3.0hz，2h)，2.94(s，1h)，2.80(s，4h)，2.71(s，1h)，2.67(q，j＝1.0hz，3h)，2.25(dd，j＝25.9，18.6hz，4h)，1.86(ddd，j＝18.9，11.5，5.8hz，4h)，1.45
‑
1.26(m，4h).
[0572]
[实施例2]化合物ii(顺式接头：nhs&降冰片烯，式2
‑1‑
2)的合成方法及结构确认
[0573]
实施例2
‑
1化合物6的合成及结构确认
[0574]
在
‑
25℃下将0.1g(0.88mmol，1.0eq)n
‑
甲基羟胺盐酸盐溶解于2ml四氢呋喃(thf)中，并搅拌所得溶液。向其添加0.07g(0.88mmol，1.0eq)戊二酸酐，搅拌所得溶液10分钟，然后向其缓慢滴加0.25ml(1.76mmol，2.0eq)三乙胺。1小时后，向其缓慢滴加0.14g(0.88mmol，1.0eq)的(1s，2r，4s)
‑
双环[2.2.1]庚
‑5‑
烯
‑2‑
羰基氯和0.12ml(0.88mmol，1.0eq)三乙胺，然后反应在室温下进行1小时。减压浓缩除去反应溶液后，残留物重新溶解在乙酸乙酯(ea)中，所得溶液用10％柠檬酸溶液洗涤三次，并用饱和盐溶液和硫酸钠干燥。未经纯化在下一步反应中使用目标化合物。tlc(dcm∶meoh＝3∶1，乙酸1滴)；r
f
＝0.4。
[0575]
计算质量(m h) ：282.13g/mol
[0576]
测量质量(m h) ：282.1g/mol
[0577]
实施例2
‑
2化合物ii的合成
[0578]
将化合物6溶解于2ml二氯甲烷(dcm)中，并向其缓慢滴加0.22g(0.73mmol，0.8eq)tstu和0.15ml(0.88mmol，1.0eq)n，n
‑
二异丙基乙胺(dipea)。反应1小时后，使用10％柠檬酸溶液洗涤反应溶液三次，并使用饱和碳酸氢钠溶液、饱和盐溶液和硫酸钠干燥。通过柱层析(ea∶hex＝1∶1)纯化目标化合物；tlc(ea∶hex＝2∶1)r
f
＝0.4(参见图3)。
[0579]
实施例2
‑
3化合物ii的结构确认
[0580]
通过实施例2
‑
1和实施例2
‑
2规定的方法合成最终化合物ii，并通过图6所示的hplc分析确认异构体的存在。根据图6所示的分析条件进行hplc纯化，通过hplc分析得到纯度如图7所示的化合物ii(顺式)。通过质谱仪对经纯化的化合物ii的结构分析进行确认，完成对最终化合物ii的分析。
[0581]
计算质量(m h) ：379.14g/mol
[0582]
测量质量(m h) ：379.0g/mol
[0583]
[实施例3]确认异构体化合物6(顺式接头或反式接头：nhs&降冰片烯)的结构
[0584]
利用高速液相色谱(hplc)装置对作为异构体的化合物6的顺式和反式结构进行了确认。对于hplc分析，使用来自waters的waters 2695hplc型，并使用xbridge c18(4.6
×
250mm，5μm，waters)作为分析柱，并且在流动相溶剂的情况下，使用含有0.1％三氟乙酸的水作为a溶剂和含有0.075％三氟乙酸的乙腈作为b溶剂。根据上述描述，通过在220nm波长
处的吸光度来分析每种结构的特征。
[0585]
如图3所示，经确认，对于化合物6的顺式结构在14.89分钟时观察到峰，对于化合物6的反式结构在15.32分钟时观察到峰。通过质谱仪(shimadzu，lcms
‑
8050)确认对每个结构的分析，图4和图5示出了化合物6的顺式和反式结构的质谱分析结果。作为确认分子量的结果，作为对应各峰的物质，确认观察到结合有一个氢分子的分子量282。
[0586]
计算质量(m h)

：282.13g/mol
[0587]
测量质量(m h)

：282.1g/mol
[0588]
[实施例4]fc结合肽的合成及结构确认
[0589]
实施例4
‑
1.fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的合成及结构确认
[0590]
[式10]
[0591]
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯
[0592][0593]
实施例4
‑1‑
1：fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的合成
[0594]
使用的fmoc氨基酸列表和使用的fmoc氨基酸的引入顺序
[0595]
fmoc
‑
l
‑
thr(tbu)
‑
oh，fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
trp(boc)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
val
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
leu
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
glu(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
gly
‑
oh，fmoc
‑
lys(boc)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
his(trt)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
trp(boc)
‑
oh，fmoc
‑
ala
‑
oh，fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh，fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh.
[0596]
制备方法
[0597]
(a)氨基酸的引入
[0598]
以下过程中使用的试剂量基于0.25mmol。将0.5g透明酰胺树脂(0.48mmol/g，peptides international，usa)放入合成反应器中，按肽氨基酸序列从c
‑
端到n
‑
端的顺序称量并制备1mmol的各个fmoc
‑
氨基酸嵌段。
[0599]
通过活化fmoc
‑
氨基酸，从c
‑
端氨基酸依次进行将经活化的残基连接到透明酰胺树脂的反应。
[0600]
在含有20％哌啶的dmf中脱除fmoc，并且为了活化和引入残基，将根据序列制备的氨基酸与2ml含有0.5m hobt的dmf溶液、2ml含有0.5m hbtu的dmf溶液和174μl dipea混合5分钟，然后将所得混合物倒入含有树脂的反应器中并混合2小时。
[0601]
通过kaiser试验方法进行引入反应的确认，当确认无反应时，再次重复引入反应，或用含有20％ac2o的dmf溶液进行封盖。在进行每个引入反应和fmoc脱除过程的下一步之
前，用dmf和dcm充分清洗树脂。重复进行这样的过程直到完成目标肽序列。
[0602]
(b)h
‑
peg8
‑
oh的引入
[0603]
在完成所有氨基酸引入后，在n
‑
端引入h
‑
peg8‑
oh，将1ml 0.5m fmoc
‑
n
‑
氨基
‑
dpeg8
‑
酸的dmf溶液、1ml含有0.5m hbtu的dmf溶液、1ml含有0.5m hobt的dmf溶液、以及87μl dipea混合5分钟，然后将所得混合物倒入含有树脂的反应器中并混合2小时。
[0604]
反应过程通过kaiser试验方法确认，当确定未反应的胺残留时，反应时间进一步延长1至3小时，或者清空反应溶液，再次重复上述反应过程。用含20％哌啶的dmf脱除n
‑
端fmoc保护基，然后对连接有肽的树脂进行干燥并称重。
[0605]
(c)降冰片烯的引入
[0606]
为了脱除n
‑
端fmoc保护基，将4eq.降冰片烯羧酸、2ml含有0.5m hobt的dmf溶液、2ml含有0.5m hbtu的dmf溶液和174μl dipea与树脂混合5分钟，然后将所得混合物倒入含有树脂的反应器中并混合2小时。通过kaiser试验方法对引入反应进行确认，确认无反应后，再次重复引入反应。
[0607]
(d)在室温下，通过使步骤(c)中制备的250mg连接有肽的树脂与tfa、tis、水和edt(94:1.0:2.5:2.5)的2ml混合物搅拌120分钟，使肽从树脂上裂解。将裂解混合物过滤，用氮气将滤液浓缩约一半，然后倒入乙醚以使肽沉淀。将沉淀的肽进一步用乙醚洗涤三次，并用氮气干燥。将干燥的沉淀物溶解在含有0.1％tfa
‑
30％acn的水中，将所得溶液搅拌6小时，然后浓缩。
[0608]
将浓缩物溶于含有5％
‑
dmso
‑
20％
‑
acn的0.01m乙酸铵缓冲液(ph6.5)中后(浓度为0.1mg/ml)，在暴露于空气的状态下搅拌所得溶液3天。通过hplc观察二硫键形成反应的进程，当确定反应不再继续进行时，将反应溶液冷冻干燥，以获得肽沉淀。
[0609]
(e)纯化
[0610]
在下表5所示的prep
‑
lc条件下，将步骤(d)中通过冻干获得的肽沉淀纯化并冻干。通过分析型hplc证实每种获得的肽均具有90％以上的纯度，并且结果如图8所示。
[0611]
降冰片烯
‑
peg8
‑
asp
‑
cys*
‑
ala
‑
trp
‑
his
‑
lys
‑
gly
‑
glu
‑
leu
‑
val
‑
trp
‑
cys*
‑
thr
‑
nh2(cys*：二硫键结合位点)
[0612]
[表5]
[0613][0614]
实施例4
‑1‑
2：fcbp(6lys)
‑
降冰片烯(氧化态)结构的确认
[0615]
通过基于lc质量的分子量测量对fcbp(6lys)的合成进行确认。
[0616]
测量仪器：waters quattro premier xe
[0617]
计算分子量：2088.40g/mol
[0618]
测量分子量(m/2 h)
2
：1044.84g/mol
[0619]
结果如图9所示。
[0620]
实施例4
‑
2.化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的合成及结构确认
[0621]
[式11]
[0622]
化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯
[0623][0624]
实施例4
‑2‑
1：化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的合成
[0625]
在dmf中合成了化合物i(反式
‑
降冰片烯weinreb酰胺)
‑
fcbp，为了将化合物i引入fcbp(6lys)
‑
降冰片烯中，将3eq的dipea和3μmol的化合物i溶解在溶于dmf的2.5μmol的fcbp(6lys)
‑
降冰片烯中，并搅拌得到的溶液。
[0626]
为了确认引入反应，通过hplc进行分析，当反应未终止时，通过在其中以1eq增量添加dipea来观察反应终止。
[0627]
确定反应终止后，浓缩反应液，通过制备型hplc纯化i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯。纯化后冷冻干燥，得到2.07μmol，纯度同样用hplc确认(纯度：>95％(hplc)，产率：83％)。
[0628]
结果如图10所示。
[0629]
实施例4
‑2‑
2：化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的结构确认
[0630]
通过基于lc质量的分子量测量对化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的合成进行确认。
[0631]
测量仪器：waters quattro premier xe
[0632]
计算分子量：2351.69g/mol
[0633]
测量分子量(m/2 h)
2
：1176.42g/mol
[0634]
结果如图11所示。
[0635]
实施例4
‑
3.化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的合成及结构确认
[0636]
[式12]
[0637]
化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯
[0638][0639]
实施例4
‑3‑
1：化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的合成
[0640]
在dmf中合成了化合物ii(顺式
‑
降冰片烯weinreb酰胺)
‑
fcbp，并且为了将化合物ii引入fcbp(6lys)
‑
降冰片烯中，将3eq的dipea和3μmol的化合物ii溶解在溶于dmf的2.5μmol fcbp(6lys)
‑
降冰片烯中，并搅拌所得溶液。
[0641]
为了确认引入反应，通过hplc进行分析，并且当反应未终止时，通过在其中以1eq增量添加dipea来观察反应终止。
[0642]
确定反应终止后，浓缩反应溶液，通过制备型hplc纯化ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯。纯化后冷冻干燥，得到2.02μmol，纯度同样用hplc确认(纯度：>95％(hplc)，产率：81％)。
[0643]
结果如图12所示。
[0644]
实施例4
‑3‑
2：化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的确认
[0645]
测量仪器：waters quattro premier xe
[0646]
计算分子量：2351.69g/mol
[0647]
测量分子量(m/2 h)
2
：1176.42g/mol
[0648]
结果如图13所示。
[0649]
[实施例5]抗体
‑
点击化学试剂的合成方法及结构确认
[0650]
实施例5
‑
1：抗体
‑
降冰片烯
[0651]
实施例5
‑1‑
1：曲妥珠单抗
‑
降冰片烯的合成方法(1)
[0652]
使用化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的引入反应
[0653]
在ph 7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液中使用化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯合成ab(lys 246/248)
‑
降冰片烯。为了将降冰片烯引入抗体的两个特异性位点，将每抗体的6eq的化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯加入至反应溶液中，然后进行反应。反应在室温下进行1周以上，通过hic
‑
hplc确认反应监测和终止。为了纯化，通过三次渗析(ph5.5，20mm组氨酸乙酸酯缓冲液)和尺寸排阻色谱法(截留分子量40kda)进行纯化。
[0654]
化合物i
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯与抗体的反应如图14所示，最终产物ab(lys 246/248)
‑
降冰片烯的结构如图15所示，通过hic
‑
hplc进行的反应监测如图16所示。
[0655]
实施例5
‑1‑
2：曲妥珠单抗
‑
降冰片烯的合成方法(2)
[0656]
化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯的引入反应
[0657]
在ph7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液中使用化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯合成ab(lys 246/248)
‑
降冰片烯。为了将降冰片烯引入抗体的两个特异性位点，将每抗体
的6eq的化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯加入至反应溶液中，然后进行反应。反应在室温下进行12小时，并通过hic
‑
hplc确认反应监测和终止。通过三次渗析(ph5.5，20mm组氨酸乙酸酯缓冲液)和尺寸排阻色谱法(截留分子量40kda)进行纯化，以从150mg曲妥珠单抗获得135mg产物(产率＝90％)。
[0658]
化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯与抗体的反应如图17所示，且产物ab(lys246/248)
‑
降冰片烯的结构如图18所示。通过hic
‑
hplc进行的反应监测如图19所示。
[0659]
实施例5
‑2‑
1：赫赛汀
‑
降冰片烯结合的确认
[0660]
基于质谱仪对抗体中包含fcbp降冰片烯接头的抗体中间体的确认进行验证(图18)。
[0661]
测量仪器：ultraflex iii(tof/tof)
[0662]
分析模式：线性模式
[0663]
极性：正极
[0664]
检测：m/z 2,000至300,000
[0665]
激光重复频率：100hz
[0666]
发射次数：1,000次
[0667]
偏转：开，5,000da
[0668]
电压：离子源i 25.00kv，离子源ii 23.00kv，透镜9.00kv
[0669]
计算分子量：152,385g/mol
[0670]
测量分子量：152,407g/mol(m na)
[0671]
分析结果如图20所示。
[0672]
[实施例6]抗体药物偶联物的合成与确认
[0673]
实施例6
‑
1：抗体
‑
药物偶联物
[0674]
实施例6
‑1‑
1：曲妥珠单抗
‑
dm1的合成方法
[0675]
使用曲妥珠单抗合成抗体
‑
载荷部分偶联物，其中通过化合物ii
‑
fcbp(6lys)
‑
降冰片烯引入两个降冰片烯分子(图18)。反应在4.5mg/ml浓度下进行，用量为25ml，并尝试将四嗪
‑
peg8
‑
dm1药物与偶联至抗体的降冰片烯进行双正交化学偶联。相对于抗体，使用4eq的药物，在ph为5.5的20mm组氨酸乙酸酯溶液中在室温下进行24小时的偶联反应。偶联反应的观察通过hic
‑
hplc确认，并且随着抗体
‑
fcbp接头与药物反应，通过观察9.4分钟范围内的峰转变至11.2分钟范围(仅当fcbp接头与曲妥珠单抗结合时出现)，来观察抗体
‑
载荷部分偶联物的生成。
[0676]
产物抗体
‑
载荷部分偶联物的结构示于图21中，通过hic
‑
hplc进行的反应监测示于图22中。在图21中，放大的结构是载荷部分的结构，未放大的部分与图18中所示的结构相同。
[0677]
实施例6
‑1‑
2：曲妥珠单抗
‑
dm1纯化方法
[0678]
为了获得高纯度的抗体
‑
载荷部分偶联物，使用ph5.5的20mm组氨酸乙酸酯溶液进行渗析，并使用快速蛋白质液相色谱(fplc)进行hic纯化。
[0679]
hic纯化条件如下。
[0680]
fplc模式：akta pure
[0681]
流速：1ml/min
[0682]
柱：hiprep butyl ff16/10柱
[0683]
洗脱溶剂：(a)1.5m硫酸铵 50mm磷酸盐ph7.0
[0684]
(b)50mm磷酸盐ph7.0
[0685]
洗脱条件
[0686]
0:00
‑
10:00a:40％，b:60％
[0687]
10:00
‑
20:00a:65％，b:35％
[0688]
20:00
‑
102.5:00a:75％，b:25％
[0689]
102:5
‑
115:00a:100％，b:0％
[0690]
115:00
‑
135:00a:100％，b:0％
[0691]
纯化的抗体
‑
载荷部分偶联物的hic色谱图如图19所示。
[0692]
通过上述方法，获得67mg曲妥珠单抗
‑
dm1，其中药物与两个位点偶联(药物抗体比例＝2)(产率＝60％)。
[0693]
实施例6
‑1‑
3：曲妥珠单抗
‑
dm1结合的确认
[0694]
基于质谱仪对包含fcbp接头和药物的抗体
‑
载荷部分偶联物的确认进行验证。
[0695]
测量仪器：ultraflex iii(tof/tof)
[0696]
分析模式：线性模式
[0697]
极性：正极
[0698]
检测：m/z 2,000至300,000
[0699]
激光重复频率：100hz
[0700]
发射次数：1,000次
[0701]
偏转：开，5,000da
[0702]
电压：离子源i 25.00kv，离子源ii 23.00kv，透镜9.00kv
[0703]
计算分子量：155,493g/mol
[0704]
测量分子量：155,523g/mol(近似值，m na)
[0705]
分析结果如图23所示。
[0706]
[实施例7]新型抗体
‑
药物偶联物(adc，曲妥珠单抗
‑
dm1偶联物)在细胞水平方面(体外细胞毒性试验)的药效评价
[0707]
基于癌细胞的靶标记物水平，对抗体
‑
载荷部分偶联物(adc，曲妥珠单抗
‑
dm1偶联物)的疗效进行评价，并且使用对于靶抗原her2的阳性表达细胞系而言的nci
‑
n87和bt474以及对于阴性细胞系而言的mda
‑
mb
‑
468进行细胞毒性试验。在her2过表达细胞nci
‑
n87和bt474中，作为通过在每种浓度下用制备的抗体药物偶联物处理细胞的观察结果，确认了极好的抗癌作用，ic50值为82.1ng/ml和29.6ng/ml。当与市售的赫赛汀adc、kadcyla进行比较时，确认到了同等水平的效果，因此作为新型adc的实用性可以得到确认。
[0708]
实验结果如图24至图27所示。
[0709]
[实施例8]新型抗体
‑
载荷部分偶联物(adc，曲妥珠单抗
‑
dm1偶联物)在动物水平方面(体内细胞毒性试验)的药效评价
[0710]
通过皮下移植过表达靶抗原的nci
‑
n87胃癌细胞系来制备移植瘤模型，并且通过将移植瘤模型分成四组，对给予的物质进行抗癌效力测试。由于本实验中使用的balb/c裸鼠缺乏t细胞，因此癌细胞容易移植到小鼠中，从而将小鼠用作适于采用啮齿动物进行抗癌
效力测试的模型。
[0711]
(a)细胞系的制备
[0712]
将含有热灭活10％胎牛血清(fbs，gibco，10082
‑
742)的rpmi1640培养基(gibco，22400
‑
089)放入细胞培养瓶中，向其中添加1小瓶人肿瘤细胞系(nci
‑
n87细胞系)，并在5％co2培养箱中于37℃培养。用pbs洗涤培养瓶，通过将2.5％胰蛋白酶
‑
edta(gibco，15090)稀释10倍来分离细胞后，然后向其中加入稀释后的胰蛋白酶
‑
edta，将细胞离心(1,000rpm，5分钟)后丢弃上清液，然后用新培养基获得细胞悬浮液。在使用显微镜确认细胞活性后，通过在浓度为1.25
×
107个细胞/ml的培养基和基质胶(matrigel)以1:1混合的溶液中对细胞悬浮液进行稀释来制备细胞系。
[0713]
(b)细胞系的移植
[0714]
根据'4.3)(4)细胞系'的制备中描述的方法对细胞系进行制备。当制备细胞系时，将细胞系重新悬浮并均化，并立即将制备的细胞系给予至动物。当移植细胞系时，动物的背部用70％酒精消毒，通过用拇指和食指拉动颈部背部的皮肤在皮肤和肌肉之间产生空间，然后将配置有26号针的注射针从动物的前部插入拇指和食指之间的皮下空间中，以2.5
×
106个细胞/0.2ml/头的剂量皮下给予细胞系。在环境适应期间，选择健康的动物，并用细胞系对所选择的动物进行接种。因此，当细胞系移植部位的大小达到约100mm3至150mm3时，根据肿瘤大小排序进行分布，使得各组中肿瘤的大小尽可能均匀地分布。
[0715]
(c)试验组配置、剂量和给药方法的确定
[0716]
细胞系＝nci
‑
n87
[0717]
小鼠类型＝balb/c裸鼠(cann.cg
‑
foxn1nu/crljori)
[0718]
组数＝5
[0719]
给药方法＝使用静脉注射(26号针注射器)
[0720]
剂量＝5mg/kg
[0721]
剂量数＝1次/2天，三次给药
[0722]
观察期＝5周
[0723]
第1组：pbs，第2组：赫赛汀(曲妥珠单抗)，第3组：新制备的adc(赫赛汀
‑
dm1偶联物，1.5st adc)
[0724]
(d)观察和检查项目
[0725]
一般症状
[0726]
在给药和观察期间，对于每个个体每天观察并记录一般症状类型，包括死亡、发病日期和症状程度。出现严重一般症状的个体将被隔离。
[0727]
体重
[0728]
在分组或开始给予试验物质的当天测量体重，之后两次/周。
[0729]
肿瘤大小的测量
[0730]
从试验物质开始给予之日起5周内以2次/周来测量肿瘤大小。使用卡尺测量肿瘤的长轴和短轴，并使用下式计算肿瘤大小。
[0731]
肿瘤大小＝ab2/2(a：长轴长度，b：短轴长度)
[0732]
(e)结果
[0733]
注射有磷酸盐缓冲盐水(pbs)和赫赛汀(曲妥珠单抗)的组在5周的观察期内没有
显示出抑制肿瘤生长的趋势。与赫赛汀相比，通过本技术制备的抗体
‑
载荷部分偶联物(赫赛汀
‑
dm1)确认具有优异的抑制肿瘤生长的能力，因此确认抗体
‑
载荷部分偶联物成功地起到adc的作用。
[0734]
上述相关结果如图28和图29所示。
[0735]
[实施例9]根据碳长度合成和确认位点特异性相互作用组
[0736]
实施例9
‑
1.化合物ii
‑
fcbp(l6dap、l6dab、l6orn、l6lys)
‑
降冰片烯的合成和结构确认
[0737]
化合物ii
‑
fcbp(l6dap、l6dab、l6orn、l6lys)
‑
降冰片烯
[0738][0739]
实施例9
‑1‑
1：fcbp(l6dap、l6dab、l6orn、l6lys)
‑
降冰片烯的合成
[0740]
fcbp(l6dap)：使用的fmoc氨基酸列表和使用的fmoc氨基酸的引入顺序(n＝1)
[0741]
fmoc
‑
l
‑
thr(tbu)
‑
oh，fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
trp(boc)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
val
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
leu
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
glu(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
gly
‑
oh，fmoc
‑
dap(boc)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
his(trt)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
trp(boc)
‑
oh，fmoc
‑
ala
‑
oh，fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh，fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh.
[0742]
fcbp(l6dab)：使用的fmoc氨基酸列表和使用的fmoc氨基酸的引入顺序(n＝2)
[0743]
fmoc
‑
l
‑
thr(tbu)
‑
oh，fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
trp(boc)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
val
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
leu
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
glu(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
gly
‑
oh，fmoc
‑
dab(boc)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
his(trt)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
trp(boc)
‑
oh，fmoc
‑
ala
‑
oh，fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh，fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh.
[0744]
fcbp(l6orn)：使用的fmoc氨基酸列表和使用的fmoc氨基酸的引入顺序(n＝3)
[0745]
fmoc
‑
l
‑
thr(tbu)
‑
oh，fmoc
‑
cys(tit)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
trp(boc)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
val
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
leu
‑
oh，fmocl
‑
glu(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
gly
‑
oh，fmoc
‑
orn(boc)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
his(trt)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
trp(boc)
‑
oh，fmoc
‑
ala
‑
oh，fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh，fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh.
[0746]
fcbp(l6lys)：使用的fmoc氨基酸列表和使用的fmoc氨基酸的引入顺序(n＝4)
[0747]
fmoc
‑
l
‑
thr(tbu)
‑
oh，fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
trp(boc)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
val
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
leu
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
glu(otbu)
‑
oh，fmoc
‑
gly
‑
oh，fmoc
‑
lys(boc)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
his(trt)
‑
oh，fmoc
‑
l
‑
trp(boc)
‑
oh，fmoc
‑
ala
‑
oh，fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh，fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh.
[0748]
制备方法
[0749]
(a)氨基酸的引入
[0750]
以下过程中使用的试剂量基于0.25mmol。将0.5g透明酰胺树脂(0.48mmol/g，peptides international，usa)放入合成反应器中，按肽氨基酸序列从c
‑
端到n
‑
端的顺序称量并制备1mmol每个fmoc
‑
氨基酸嵌段。
[0751]
通过活化fmoc
‑
氨基酸进行将经活化的残基连接到透明酰胺树脂的反应，且该反应从c
‑
端氨基酸开始依次进行。
[0752]
在含有20％哌啶的dmf中脱除fmoc，并且为了活化和引入残基，将根据序列制备的氨基酸与2ml含有0.5m hobt的dmf溶液、2ml含有0.5m hbtu的dmf溶液和174μl dipea混合5分钟，然后将所得混合物倒入含有树脂的反应器中并混合2小时。
[0753]
采用kaiser试验方法确认引入反应，当确认无反应时，再次重复引入反应，或用含有20％ac2o的dmf溶液进行封盖。在进行每个引入反应和fmoc脱除过程的下一步之前，用dmf和dcm充分清洗树脂。重复进行这样的过程直到完成目标肽序列。
[0754]
(b)h
‑
peg8
‑
oh的引入
[0755]
在完成所有氨基酸引入后，在n
‑
端引入h
‑
peg8‑
oh，将1ml 0.5m fmoc
‑
n
‑
氨基
‑
dpeg8
‑
酸的dmf溶液、1ml含有0.5m hbtu的dmf溶液、1ml含有0.5m hobt的dmf溶液、以及87μl dipea混合5分钟，然后将所得混合物倒入含有树脂的反应器中并混合2小时。
[0756]
反应过程通过kaiser试验方法确认，当确定未反应的胺残留时，反应时间进一步延长1至3小时，或者清空反应溶液，再次重复上述反应过程。用含20％哌啶的dmf脱除n
‑
端fmoc保护基，然后对连接有肽的树脂进行干燥并称重。
[0757]
(c)降冰片烯的引入
[0758]
为了脱除n
‑
端fmoc保护基，将4eq.降冰片烯羧酸、2ml含有0.5m hobt的dmf溶液、2ml含有0.5m hbtu的dmf溶液和174μl dipea与树脂混合5分钟，然后将所得混合物倒入含有树脂的反应器中并混合2小时。采用kaiser试验方法对引入反应进行确认，确认无反应后，再次进行引入反应。
[0759]
(d)在室温下，通过使步骤(c)中制备的250mg连接有肽的树脂与tfa、tis、水和edt(94:1.0:2.5:2.5)的2ml混合溶液搅拌120分钟，使肽从树脂上裂解。将裂解混合物过滤，用氮气将滤液浓缩约一半，然后倒入乙醚以使肽沉淀。将沉淀的肽进一步用乙醚洗涤三次，并用氮气干燥。将干燥的沉淀物溶解在含有0.1％tfa
‑
30％acn的水中，将所得溶液搅拌6小时，然后浓缩。
[0760]
将浓缩物溶于含有5％
‑
dmso
‑
20％
‑
acn的0.01m乙酸铵缓冲液(ph6.5)中后(浓度为0.1mg/ml)，在暴露于空气的状态下搅拌所得溶液3天。通过hplc观察二硫键形成反应的进程，并且当确定反应不再继续进行时，将反应溶液冷冻干燥，以获得肽沉淀。
[0761]
(e)纯化
[0762]
在下表6所示的prep
‑
lc条件下，将步骤(d)中通过冻干获得的肽沉淀纯化并冻干。确认每种获得的肽均具有90％以上的纯度。
[0763]
(f)序列
[0764]
fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯：
[0765]
降冰片烯
‑
peg8
‑
asp
‑
cys*
‑
ala
‑
trp
‑
his
‑
dap
‑
gly
‑
glu
‑
leu
‑
val
‑
trp
‑
cys*
‑
thr
‑
nh2[0766]
(cys*：二硫键结合位点)
[0767]
fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯：
[0768]
降冰片烯
‑
peg8
‑
asp
‑
cys*
‑
ala
‑
trp
‑
his
‑
dab
‑
gly
‑
glu
‑
leu
‑
val
‑
trp
‑
cys*
‑
thr
‑
nh2[0769]
(cys*：二硫键结合位点)
[0770]
fcbp(l6dorn)降冰片烯：
[0771]
降冰片烯
‑
peg8
‑
asp
‑
cys*
‑
ala
‑
trp
‑
his
‑
orn
‑
gly
‑
glu
‑
leu
‑
val
‑
trp
‑
cys*
‑
thr
‑
nh2[0772]
(cys*：二硫键结合位点)
[0773]
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯：
[0774]
降冰片烯
‑
peg8
‑
asp
‑
cys*
‑
ala
‑
trp
‑
his
‑
lys
‑
gly
‑
glu
‑
leu
‑
val
‑
trp
‑
cys*
‑
thr
‑
nh2[0775]
(cys*：二硫键结合位点)
[0776]
[表6]
[0777][0778]
实施例9
‑1‑
2：化合物ii
‑
fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯的合成
[0779]
在dmf中合成了化合物ii(顺式
‑
降冰片烯weinreb酰胺)
‑
fcbp，为了将化合物ii引入fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯中，将3eq的dipea和8.4μmol的化合物ii溶解在溶于dfm的7.3μmol fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯中，并搅拌所得溶液。
[0780]
确认反应终止后，浓缩反应溶液，通过制备型hplc纯化化合物ii
‑
fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯。纯化后冷冻干燥得到14.1mg，纯度同样用hplc确认(纯度：>99％(hplc)，产率：83％)。
[0781]
结果如图30所示。
[0782]
实施例9
‑1‑
3：化合物ii
‑
fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯的结构确认
[0783]
测量仪器：waters quattro premier xe
[0784]
计算分子量：2309.61g/mol
[0785]
测量分子量(m/2 h)
2
：1155.08g/mol
[0786]
结果如图31所示。
[0787]
实施例9
‑1‑
4：化合物ii
‑
fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯的合成
[0788]
在dmf中合成了化合物ii(顺式
‑
降冰片烯weinreb酰胺)
‑
fcbp，为了将化合物ii引入至fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯中，将3eq的dipea和8.4μmol的化合物ii溶解在溶于dfm的7.3μmol fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯中，并搅拌所得溶液。
[0789]
确认反应终止后，浓缩反应溶液，通过制备型hplc纯化化合物ii
‑
fcbp(l6dab)
‑
降
冰片烯。纯化后冷冻干燥，得到13.8mg，纯度同样用hplc确认(纯度：>99％(hplc)，产率：82％)。
[0790]
结果如图32所示。
[0791]
实施例9
‑1‑
5：化合物ii
‑
fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯的结构确认
[0792]
测量仪器：waters quattro premier xe
[0793]
计算分子量：2323.64g/mol
[0794]
测量分子量(m/2 h)
2
：1162.02g/mol
[0795]
结果如图33所示。
[0796]
实施例9
‑1‑
6：化合物ii
‑
fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯的合成
[0797]
在dmf中合成了化合物ii(顺式
‑
降冰片烯weinreb酰胺)
‑
fcbp，并且为了将化合物ii引入fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯中，将3eq的dipea和8.3μmol的化合物ii溶解在溶于dfm的7.2μmol fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯中，并搅拌所得溶液。
[0798]
确认反应终止后，浓缩反应溶液，通过制备型hplc纯化化合物ii
‑
fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯。纯化后冷冻干燥，得到14.8mg，纯度同样用hplc确认(纯度：>99％(hplc)，产率：88％)。
[0799]
结果如图34所示。
[0800]
实施例9
‑1‑
7：化合物ii
‑
fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯的结构确认
[0801]
测量仪器：waters quattro premier xe
[0802]
计算分子量：2337.66g/mol
[0803]
测量分子量(m/2 h)
2
：1169.03g/mol
[0804]
结果如图35所示。
[0805]
实施例9
‑1‑
8：化合物ii
‑
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯的合成
[0806]
在dmf中合成了化合物ii(顺式
‑
降冰片烯weinreb酰胺)
‑
fcbp，为了将化合物ii引入至fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯中，将3eq的dipea和8.3μmol的化合物ii溶解在溶于dfm的7.2μmol fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯中，并搅拌所得溶液。
[0807]
确认反应终止后，浓缩反应溶液，通过制备型hplc纯化化合物ii
‑
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯。纯化后冷冻干燥，得到15.4mg，纯度同样用hplc确认(纯度：>99％(hplc)，产率：91％)。
[0808]
结果如图36所示。
[0809]
实施例9
‑1‑
9：化合物ii
‑
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯的结构确认
[0810]
测量仪器：waters quattro premier xe
[0811]
计算分子量：2351.69g/mol
[0812]
测量分子量(m/2 h)
2
：1176.04g/mol
[0813]
结果如图37所示。
[0814]
[实施例10]根据碳长度验证位点特异性相互作用组的抗体结合效率
[0815]
实施例10
‑
1.通过化合物ii
‑
fcbp(l6dap、l6dab、l6orn、l6lys)
‑
降冰片烯制备位点特异性抗体
‑
降冰片烯偶联物
[0816]
实施例10
‑1‑
1：基于化合物ii
‑
fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯的曲妥珠单抗
‑
降冰片烯的合成
[0817]
在ph7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液中使用化合物ii
‑
fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯合成ab(lys 246/248)
‑
降冰片烯。为了将降冰片烯引入抗体(曲妥珠单抗4mg/ml，1ml)的两个特异性位点，将每抗体6eq的化合物ii
‑
fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯加入反应溶液中，然后进行反应。对于反应温度和时间，在室温下进行反应12小时，并且通过hic
‑
hplc确认反应监测和终止。曲妥珠单抗在hic
‑
hplc上在6.3
‑
6.4分钟处显示出峰。当fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯分子仅与曲妥珠单抗的两个结合位点中的一个结合时，在hic
‑
hplc上在8分钟处观察到峰。当fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯分子与曲妥珠单抗的两个位点结合时，在hic
‑
hplc上在9分钟处观察到峰。在图38中示出了监测与基于化合物ii
‑
fcbp(l6dap)
‑
降冰片烯的抗体的结合反应。通过观察9.074分钟处的峰，确认合成了dar＝2的抗体
‑
载荷部分偶联物。
[0818]
实施例10
‑1‑
2：基于化合物ii
‑
fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯的曲妥珠单抗
‑
降冰片烯的合成
[0819]
在ph7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液中使用化合物ii
‑
fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯合成ab(lys 246/248)
‑
降冰片烯。为了将降冰片烯引入抗体(曲妥珠单抗4mg/ml，1ml)的两个特异性位点，将每抗体6eq的化合物ii
‑
fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯加入反应溶液中，然后进行反应。对于反应温度和时间，在室温下进行反应12小时，并且通过hic
‑
hplc确认反应监测和终止。曲妥珠单抗在hic
‑
hplc上在6.3
‑
6.4分钟处显示出峰。当fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯分子仅与曲妥珠单抗的两个结合位点中的一个结合时，在hic
‑
hplc上在8分钟处观察到峰。当fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯分子与曲妥珠单抗的两个位点结合时，在hic
‑
hplc上在9分钟处观察到峰。在图39中示出了监测与基于化合物ii
‑
fcbp(l6dab)
‑
降冰片烯的抗体的结合反应。通过观察9.231分钟处的峰，确认合成了dar＝2的抗体
‑
载荷部分偶联物。
[0820]
实施例10
‑1‑
3：基于化合物ii
‑
fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯的曲妥珠单抗
‑
降冰片烯的合成
[0821]
在ph7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液中使用化合物ii
‑
fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯合成ab(lys 246/248)
‑
降冰片烯。为了将降冰片烯引入抗体(曲妥珠单抗4mg/ml，1ml)的两个特异性位点，将每抗体6eq的化合物ii
‑
fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯加入反应溶液中，然后进行反应。对于反应温度和时间，在室温下进行反应12小时，并且通过hic
‑
hplc确认反应监测和终止。曲妥珠单抗在hic
‑
hplc上在6.3
‑
6.4分钟处显示出峰。当fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯分子仅与曲妥珠单抗的两个结合位点中的一个结合时，在hic
‑
hplc上在8分钟处观察到峰。当fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯分子与曲妥珠单抗的两个位点结合时，在hic
‑
hplc上在9分钟处观察到峰。在图40中示出了监测与基于化合物ii
‑
fcbp(l6orn)
‑
降冰片烯的抗体的结合反应。通过观察8.975分钟处的峰，确认合成了dar＝2的抗体
‑
载荷部分偶联物。
[0822]
实施例10
‑1‑
4：基于化合物ii
‑
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯的曲妥珠单抗
‑
降冰片烯的合成
[0823]
在ph7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液中使用化合物ii
‑
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯合成ab(lys 246/248)
‑
降冰片烯。为了将降冰片烯引入抗体(曲妥珠单抗4mg/ml，1ml)的两个特异性位点，将每抗体6eq的化合物ii
‑
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯加入反应溶液中，然后进行反应。对于反应温度和时间，在室温下进行反应12小时，并且通过hic
‑
hplc确认反应监测和终止。曲妥珠单抗在hic
‑
hplc上在6.3
‑
6.4分钟处显示出峰。当fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯分子仅与曲妥珠单抗的两个结合位点中的一个结合时，在hic
‑
hplc上在8分钟处观察到峰。当
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯分子与两个位点结合时，在hic
‑
hplc上在9分钟处观察到峰。在图41中示出了监测与基于化合物ii
‑
fcbp(l6lys)
‑
降冰片烯的抗体的结合反应。通过观察9.120分钟处的峰，确认合成了dar＝2的抗体
‑
载荷部分偶联物。