一种乳酸菌的保藏方法与流程

1.本发明涉及微生物菌种保藏领域，具体为一种乳酸菌的保藏方法。


背景技术：

2.目前微生物菌种通常采用定期移植保藏法、液体石蜡保藏法、冷冻干燥、液氮超低温保藏法。低温条件下保藏可减缓微生物菌种的代谢活动，抑制其繁殖速度，达到减少菌株突变，延长菌种保藏时间的目的。
3.定期移植保藏法：是一种经典的简易保藏法，也称为传代保藏法。该法包括斜面培养、液体培养和穿刺培养等。这种方法优点是操作简单，缺点是斜面培养基与空气接触面大，脱水较快，一般在半年内就会干缩；棉塞容易吸水变潮，容易导致菌种染菌；保藏温度较高，菌种仍有一定的代谢活动，可进行繁殖，为了防止菌种死亡，通常3～4个月就应该传代转管，不但加大了工作量，而且还会由于菌种传代频繁，菌种变异频率较高，活力减弱。
4.液体石蜡保藏法：基本方法与定期移植保藏法相同，为了防止因培养基的水分蒸发和阻止氧气进入，在斜面培养物上覆盖液体石蜡。该方法优点是菌种保藏时间长，一般2～10年不等，缺点是只适应于不能分解液体石蜡的微生物菌种的保藏；菌种保藏时必须用试管架竖直摆放，保藏占用的空间较大，整个操作比较繁琐。
5.冷冻干燥法是将拟保藏的菌种悬浮液处于低温冻结状态，在真空条件下使之升华，达到干燥目的，低温、干燥和隔绝空气是菌种保藏的三要素，在该状态下，微生物处于休眠状态，代谢活动基本终止，故保藏时间较长，但设备要求高，投资大。
6.液氮超低温保藏是将菌种保藏在
‑
196℃的液态氮，或在
‑
150℃的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在
‑
130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物，此方法也是设备要求高，操作复杂。另外复苏时也比较麻烦。
7.乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称，乳酸菌具有多种生理功能,广泛应用于食品,饲料,医药等行业.延长乳酸菌活菌保藏期是目前乳酸菌制剂研制与开发的技术关键问题。
8.乳酸菌使用以上四种保藏方法都有不足之处。液体石蜡保藏法只适合斜面和穿刺培养，但斜面培养法因斜面培养基与空气接触面大不适合乳酸菌的培养，穿刺培养在菌种活化时不方便操作。冷冻干燥法和液氮超低温保藏方法操作复杂，技术含量高，设备投入高，运行成本高，只适合专业保藏机构使用，不适合生产企业使用。定期移植保藏法中的液体培养属于乳酸菌比较常见的保藏方法，但是由于液体培养必须用试管架竖直摆放，保存占用的空间较大，最重要的是液体培养每两个月左右需传代一次，否则菌种会死亡，不但加大了工作量，而且还会由于菌种传代频繁，菌种变异频率较高，活力减弱。基于以上原因急需研究一种适合企业使用的简单方便、无需总传代的乳酸菌保藏方法。


技术实现要素：

9.为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种乳酸菌的保藏方法。
10.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
11.一种乳酸菌的保藏方法，采用蔬菜作为菌种保藏载体，将乳酸菌接种到灭菌后的蔬菜颗粒和改良mrs培养基的混合液中培养，培养完成后离心，弃去上清液，收集蔬菜颗粒密封保藏，保藏温度
‑
20℃～4℃。
12.所述蔬菜颗粒和改良mrs培养基的混合液为：蔬菜颗粒20g
‑
30g、蛋白胨6g
‑
10g、牛肉膏6g
‑
10g、葡萄糖12g
‑
20g、柠檬酸三铵2g、酵母膏5g、乙酸钠2g、k2hpo
4 2g、mgso4·
7h2o 0.58g、mnso4·
4h2o 0.25g、蒸馏水1l。
13.具体为：
14.a)按所述用量将蔬菜颗粒121℃灭菌10min,冷却备用；
15.b)按所述用量将改良mrs培养基121℃灭菌15min冷却备用；
16.c)将步骤a)灭菌后的蔬菜颗粒与步骤b)灭菌后的改良mrs培养基混合；
17.d)于无菌条件下将乳酸菌按接种量1
‑
3％(v/v)接种到上述混合液中,于38
‑
42℃培养1d；
18.e)上述培养好的菌种5000r/min离心10min,弃去上清液，收集蔬菜颗粒无菌条件下42℃干燥2小时后密封保藏。
19.所述乳酸菌为植物乳杆菌、短乳杆菌或副干酪乳杆菌。
20.所述蔬菜为白菜帮、萝卜、豇豆、生姜、圆白菜或芥菜；
21.颗粒为长宽高分别不大于0.5cm的块状。
22.优选的保藏温度为1～4℃或
‑
16℃～
‑
20℃。
23.优选的蔬菜颗粒和改良mrs培养基的混合液为：蔬菜颗粒25g、蛋白胨9g、牛肉膏8g、葡萄糖14g、柠檬酸三铵2g、酵母膏5g、乙酸钠2g、k2hpo
4 2g、mgso4·
7h2o 0.58g、mnso4·
4h2o 0.25g、蒸馏水1l。
24.菌种复苏方法，将保藏的蔬菜颗粒在无菌条件下转入到液体mrs培养基中，进行适温培养即可。
25.与现有技术相比，本技术的有益效果为：
26.本发明的保藏方法克服了现有技术存在的缺陷，提供一种适用于生产企业，保藏时间长又操作简单实用、菌种质量稳定可靠，保藏成本低的微生物菌种保藏方法，具体为：
27.1.本发明使用的蔬菜特别是白菜帮是天然可食用材料,由于其内部含有大量微管束,内表面积大,利于吸附微生物细胞,且白菜帮来源丰富价格低,是一种理想菌种保藏包埋剂。
28.2.本发明利用蔬菜颗粒保藏菌种,能够解决游离菌种培养增殖难度高、对外抵抗力差,难以长期保藏的问题,提高了菌种应用的方便性,延长了菌种的保藏期，1～4℃冷藏可保藏3
‑
4年，
‑
16℃～
‑
20℃冷冻可保藏4
‑
5年。
29.3.本发明选择适当的培养基及培养条件让微生物在培养物中生长，然后离心干燥，干燥后蔬菜水分在60
‑
70％，由于菌种细胞中含水量很低，可冷藏或冷冻保藏。此方法设备投入少，在普通的冰箱就能实现菌种长期保藏，实用性强，具有操作简单、稳定可靠、成本低廉、保藏期长的特点。
30.4.本发明使用蔬菜颗粒作为保藏载体，与常见的mrs培养基保藏方法相比，减少保存空间，无需传代转管，减少了工作量。
31.5.与冷冻干燥保藏方法相比，本技术的方法不需极低温度(
‑
80℃)的快速冷冻，也不需长时间的冻干处理，本技术只需要普通冰箱的冷藏或者冷冻条件就可以实现。
附图说明
32.图1为蛋白胨含量对菌数的影响图。
33.图2为牛肉膏含量对菌数的影响图。
34.图3为葡萄糖含量对菌数的影响图。
35.图4为白菜帮颗粒含量对菌数的影响图。
具体实施方式
36.以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不局限于本实施方式中的制备方法和用途。
37.根据单因素实验筛选出改良的mrs培养基组分的最佳量范围，再用响应面试验确定最后最佳培养基配比，以发酵得到的副干酪乳杆菌菌数为指标。
38.以下实施例使用的植物乳杆菌、短乳杆菌或副干酪乳杆菌均为市购获得，购于北京百欧博伟生物：植物乳杆菌bio
‑
60181，短乳杆菌bio
‑
67750，副干酪乳杆菌bio
‑
112991。
39.一单因素试验：
40.在mrs培养基基础上选择不同数量的蛋白胨，牛肉膏，葡萄糖和白菜帮颗粒，其它成分含量不变。先单因素确定蛋白胨(4,6,8,10,12,14)，牛肉膏(4,6,8,10,12,14)，葡萄糖(8,12,16，20,24,28)，白菜帮颗粒(10,15,20,25,30,35)四因素的最佳量范围。
41.1.蛋白胨含量对菌数的影响见图1，从图1可以看出当蛋白胨含量为8g时菌数最高达117.35亿，最佳范围6
‑
10。
42.2.牛肉膏含量对菌数的影响见图2，从图2可以看出当牛肉膏含量为8g时菌数最高达115.26亿，最佳范围6
‑
10。
43.3.葡萄糖含量对菌数的影响见图3，从图3可以看出当葡萄糖含量为12g时菌数最高达110.45亿，最佳范围8
‑
16。
44.4.白菜帮颗粒含量对菌数的影响见图4，从图4可以看出当白菜帮颗粒含量为25g时菌数最高达115.13亿，最佳范围20
‑
30。
45.二响应面试验设计
46.根据单因素试验结果，选取对菌株菌数影响因素蛋白胨，葡萄糖，牛肉膏和白菜帮颗粒因素，以菌数为响应值，通过design
‑
expert 8.0.6软件设计4因素3水平box
‑
behnken响应面试验。具体方案如表1所示。对菌数进行二次多元回归方程拟合，得到各因素与响应值之间函数关系的回归方程，根据生成响应面图确定最优的培养基配方。
47.表1响应面因素水平表
48.49.以菌数为响应值，运用box
‑
benhnken设计29组试验，box
‑
benhnken试验设计及结果见表2。
50.表2 box
‑
benhnken试验设计及结果
[0051] 蛋白胨葡萄糖牛肉膏白菜粒菌数100
‑1‑
1105.442001
‑
1109.7131010113.6740000119.035
‑1‑
100107.2461100115.767
‑
1001106.2981001115.6690
‑
101109.4210010
‑
1112.001100
‑
11111.09120011112.7013
‑
1100108.33140101114.15150
‑1‑
10106.89160110114.88170000117.1418
‑
10
‑
10103.95191
‑
100106.27200000118.82210000116.1422
‑
100
‑
1104.6223
‑
1010108.16240
‑
10
‑
1109.232510
‑
10110.26260
‑
110109.012701
‑
10111.3528100
‑
1109.32290000117.11
[0052]
用design
‑
expert 8.0.6软件对表2的结果进行多元回归拟合，得到的回归方程为
[0053]
y＝ 117.65 2.70*a 2.37*b 1.60*c 1.58*d 2.10*a*b
‑
0.20*a*c 1.17*a*d 0.35*b*c 0.49*b*d
‑
0.66*c*d
‑
4.94*a2‑
3.07*b2‑
3.99*c2‑
3.68*d2。
[0054]
响应面试验结果最佳配方为：蛋白胨8.85g，葡萄糖14.27g，牛肉膏8.38g，白菜帮颗粒26.52g，菌数为119.283亿。为了方便实际操作把配方调整为：蛋白胨9g，葡萄糖14g，牛肉膏8g，白菜帮颗粒25g，按此条件进行试验，重复3次取平均值，测得菌数为119.87亿，与预
测值的相对误差为0.49％，说明方程拟合较好，响应面优化得到的培养基配方参数准确，具有实用价值。
[0055]
表3方差分析
[0056]
来源平方和自由度均方f值p值显著性模型510.561436.4722.20＜0.0001**蛋白胨87.21187.2153.08＜0.0001**葡萄糖67.26167.2640.94＜0.0001**牛肉膏30.56130.5618.600.0007**白菜粒30.05130.0518290.0008**ab17.64117.6410.740.0055**ac0.1610.160.0970.7596
‑
ad5.4515.453320.0899
‑
bc0.510.50.300.5910
‑
bd0.9610.960.580.4572
‑
cd1.7711.771.080.3171
‑
a2158.361158.3696.38＜0.0001**b260.98160.9837.11＜0.0001**c2103.451103.4562.96＜0.0001**d287.77187.7753.42＜0.0001**残差23.00141.64
ꢀꢀꢀ
失拟项16.90101.691.110.5022
‑
纯误差6.1141.53r2＝0.9569a
djr2
＝0.9138 总和533.5728
ꢀꢀꢀꢀ
[0057]
注：*表示显著(p＜0.05)，**表示极显著(p＜0.01)；
‑
表示不显著。
[0058]
通过表3可以看出，该模型的决定系数r2＝0.9569，校正决定系数a
djr2
＝0.9138，说明试验的实际值和预测值拟合度比较好。从对菌数的影响来看，一次项蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、白菜帮颗粒对菌数的影响均达到极显著水平。该回归模型p＜0.0001，表明试验所采取的二次模型极显著，失拟项的p＝0.5022＞0.05，模型失拟项不显著，表明该模型在统计学上是有意义的，改良的mrs培养基适用于乳酸菌，尤其适用于植物乳杆菌、短乳杆菌或副干酪乳杆菌。
[0059]
实施例1
[0060]
a)将25g白菜帮颗粒装于三角瓶中，121℃灭菌10min,冷却备用；
[0061]
b)将改良mrs培养基装于500ml三角瓶中，121℃灭菌15min冷却备用；
[0062]
c)将步骤a)灭菌后的白菜帮颗粒与步骤b)灭菌后的改良mrs培养基混合；
[0063]
d)于无菌条件下将植物乳杆菌按接种量1％(v/v)接种到上述混合液中，于38℃养1d；
[0064]
e)上述培养好的菌种在无菌条件下转入无菌离心管中5000r/min离心10min,弃去上清液，收集白菜帮颗粒，把离心管换上灭过菌的纱布塞，放入干燥箱42℃干燥2小时，然后转入无菌ep管中分装，最后分别置于冰箱中于4℃及
‑
18℃保藏。
[0065]
改良mrs培养基的配比：蛋白胨9g、牛肉膏8g、葡萄糖14g、柠檬酸三铵2g、酵母膏5g、乙酸钠2g、k2hpo
4 2g、mgso4·
7h2o 0.0.58g、mnso4·
4h2o 0.0.25g，蒸馏水1l。
[0066]
实施例2
[0067]
a)将25g白菜帮颗粒装于三角瓶中，121℃灭菌10min,冷却备用；
[0068]
b)将改良mrs培养基装于500ml三角瓶中，121℃灭菌15min冷却备用；
[0069]
c)将步骤a)灭菌后的白菜帮颗粒与步骤b)灭菌后的改良mrs培养基混合；
[0070]
d)于无菌条件下将短乳杆菌按接种量2％(v/v)接种到上述混合液中,于40℃培养1d；
[0071]
e)上述培养好的菌种在无菌条件下转入无菌离心管中5000r/min离心10min,弃去上清液，收集白菜帮颗粒，把离心管换上灭过菌的纱布塞，放入干燥箱42℃干燥2小时，然后转入无菌ep管中分装，最后分别置于冰箱中于4℃及
‑
18℃保藏。
[0072]
改良mrs培养基的配比：蛋白胨9g、牛肉膏8g、葡萄糖14g、柠檬酸三铵2g、酵母膏5g、乙酸钠2g、k2hpo
4 2g、mgso4·
7h2o 0.58g、mnso4·
4h2o 0.25g，蒸馏水1l。
[0073]
实施例3
[0074]
a)将25g白菜帮颗粒装于三角瓶中，121℃灭菌10min,冷却备用；
[0075]
b)将改良mrs培养基装于500ml三角瓶中，121℃灭菌15min冷却备用；
[0076]
c)将步骤a)灭菌后的白菜帮颗粒与步骤b)灭菌后的改良mrs培养基混合；
[0077]
d)于无菌条件下将副干酪乳杆菌按接种量3％(v/v)接种到上述混合液中,于42℃培养1d；
[0078]
e)上述培养好的菌种在无菌条件下转入无菌离心管中5000r/min离心10min,弃去上清液，收集白菜帮颗粒，把离心管换上灭过菌的纱布塞，放入干燥箱42℃干燥2小时，然后转入无菌ep管中分装，最后分别置于冰箱中于4℃及
‑
18℃保藏。
[0079]
改良mrs培养基的配比：蛋白胨9g、牛肉膏8g、葡萄糖14g、柠檬酸三铵2g、酵母膏5g、乙酸钠2g、k2hpo
4 2g、mgso4·
7h2o 0.58g、mnso4·
4h2o 0.25g，蒸馏水1l。
[0080]
表4实施例1
‑
3所保藏的菌种：
[0081]
实施例编号学名中文名称1lactobacillusplanetarium植物乳杆菌2lactobacillusbrevis短乳杆菌3lactobacillus paracasei副干酪乳杆菌
[0082]
表5实施例1
‑
3菌种保藏初始细胞数测定结果
[0083][0084]
表6 4℃条件下不同年限菌种保藏存活率(％)单位：年
[0085]
实施例编号中文名称1年2年3年4年
1植物乳杆菌948545142短乳杆菌928338103副干酪乳杆菌87804118
[0086]
表7
ꢀ‑
18℃条件下不同年限菌种保藏存活率(％)单位：年
[0087]
实施例编号中文名称1年2年3年4年5年1植物乳杆菌96908166582短乳杆菌95807265523副干酪乳杆菌9287766355
[0088]
由上述实施例可见，采用本实施例的保藏方法延长了菌种的保藏期，与常规的液体mrs培养基保藏1
‑
4℃只能保藏2
‑
3月，而且不可以冷冻相比，本实施例的方法1
‑
4℃冷藏可保藏3
‑
4年，
‑
16℃
‑‑
20℃冷冻可保藏4
‑
5年，操作简单实用、菌种质量稳定可靠，保藏成本低。