一对敲除猪HSPA6基因部分保守区域的sgRNA序列及应用的制作方法

一对敲除猪hspa6基因部分保守区域的sgrna序列及应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一对敲除hspa6基因部分保守区域的sgrna序列及应用。
技术背景
2.随着位点特异性核酸酶的发展，crispr/cas9因其简单、高效、低成本、多功能性和特异性而开始对生物学研究产生革命性的影响。crispr/cas9介导的基因组工程已被广泛高效地应用于各种物种中。这种功能强大的基因编辑工具可实现条件性基因敲除、基因敲入、基因替换、点突变等等，为基因的功能研究提供了一个有吸引力的策略。
3.hspa6基因是一种仅在高等哺乳动物中发现的新进化的hsp70家族的基因。hspa6基因具有严格诱导性，其基础表达水平较低或不表达，而在特定应激源的刺激下，其表达水平会迅速且显著地上升。基于该基因独特的基因表达模式，已构建了一种能有效将应激信号转变为egfp荧光信号的报告细胞系，即细胞传感器。hspa6基因也参与人类神经元细胞对蛋白毒性应激的反应，对神经退行性疾病有影响。除此之外，hspa6基因在动物应激性疾病中也有重要的作用。而目前关于hspa6基因分子调控机制方面的研究很有限，因此，本研究基于已有的工作基础和技术平台，以crispr/cas9介导的基因敲除技术探究敲除保守区对hspa6基因表达的影响。


技术实现要素：

4.本发明阐述了一段能促进猪hspa6基因表达保守区域，该部分保守区域被敲除后能显著抑制猪hspa6基因表达，能敲除该部分保守区域的物质可用于启动子区调控元件解析、细胞传感器和神经退行性疾病及应激性疾病药物靶点研究，所述的物质应用于敲除hspa6基因部分保守区域或应用在制备敲除hspa6基因部分保守区域的产品中，所述的部分保守区域的dna序列的正义链如seq id no：5所示，其对应互补链的dna序列如seq id no：6所示。
5.本发明提供的所述的物质为一对敲除猪hspa6基因部分保守区域的sgrna序列，所述的敲除基于crispr/cas9系统进行，其特征在于：所述的sgrna序列包括sgrna 2
‑
1和sgrna 2
‑
2；
6.所述的sgrna 2
‑
1的dna序列的正义链如seq id no：1所示，其对应互补链的dna序列如seq id no：2所示；
7.所述的sgrna 2
‑
2的dna序列的正义链如seq id no：3所示，其对应互补链的dna序列如seq id no：4所示。
8.本发明还提供一种试剂盒，所述的试剂盒包含所述的一对敲除猪hspa6基因部分保守区域的sgrna序列。
9.本发明还提供两种可打靶猪hspa6基因部分保守区域的crispr/cas9系统敲除载体，由所述的sgrna 2
‑
1和sgrna 2
‑
2的双链dna与线性化的px330载体连接得到，其制备方
法是：首先设计合成靶向所述猪hspa6基因部分保守区域的正链sgrna序列和负链sgrna序列；再将所述的正链sgrna序列和负链sgrna序列退火形成所述的双链dna；最后将所述的双链dna与载体连接得到打靶载体。
10.本发明还提供所述的一对敲除猪hspa6基因部分保守区域的sgrna序列在制备hspa6基因表达被显著抑制猪肾细胞中的应用，猪肾细胞在敲除所述的hspa6基因部分保守区域后发生缺失，在加热后hspa6基因表达量为239.02，相较于对照组细胞hspa6基因的表达量4569.12，下降了94.77％，经过统计学计算，其p值为0.001，小于极显著阈值0.01，由此可知，hspa6基因表达被极显著抑制。
11.本发明还提供所述的一对敲除猪hspa6基因部分保守区域的sgrna序列在制备hspa6基因表达被显著抑制猪模型中的应用。
12.本发明还提供所述的一对敲除猪hspa6基因部分保守区域的sgrna序列在以hspa6基因为靶点的神经退行性疾病及应激性疾病药物中的应用。
13.有益效果如下：
14.本发明发现了一段缺失后能显著抑制猪hspa6基因表达的启动子区的部分保守区域，并且提供一对能有效敲除该部分保守区域的sgrna序列，并验证了使用该sgrna序列敲除部分保守区域实现了显著抑制猪hspa6基因的表达的效果，本发明应用于以hspa6基因为靶点的神经退行性疾病及应激性疾病药物的研发，构建的敲除hspa6基因部分保守区域的猪源细胞可作为解析hspa6基因表达的分子调节机制的研究模型。
附图说明：
15.图1为人、牛、羊、马、猪、川金丝猴和阿拉伯骆驼的hspa6基因启动子序列比对图；
16.图2为2对不同sgrna切割效率的测序峰图；
17.图3为阳性猪肾细胞克隆鉴定的电泳图；
18.图4为克隆鉴定测序峰图
19.图5为egfp定点整合的细胞克隆的pcr鉴定电泳图；
20.图6为本发明所述的部分保守区对猪hspa6基因表达的调控功能的研究；
21.图7为加热处理后阳性克隆hspa6及egfp的mrna表达量分析图。
具体实施方式
22.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
23.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
24.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.实施例1、根据所述的hspa6基因部分保守区域设计sgrna序列及构建打靶载体。
26.根据人、牛、羊、马、猪、川金丝猴和阿拉伯骆驼的hspa6基因第一外显子前3000bp的序列，七种哺乳动物的hspa6基因启动子序列比对如图1所示，通过vector软件进行多序列比对，得到一段71bp的能极显著影响猪hspa6基因表达的部分启动子保守区域，所述的部分保守区域的dna序列的正义链如seq id no：5所示，其对应互补链的dna序列如seq id no：6所示。
27.根据所述的部分保守区域设计并合成了2对猪hspa6部分启动子保守区域的sgrna序列，其中一对为sgrna 2
‑
1和sgrna 2
‑
2；所述的sgrna 2
‑
1的dna序列的正义链如seq id no：1所示，其对应互补链的dna序列如seq id no：2所示；所述的sgrna2
‑
2的dna序列的正义链如seq id no：3所示，其对应互补链的dna序列如seq id no：4所示。另一对为sgrna 1
‑
1和sgrna 1
‑
2，所述的sgrna 2
‑
1的dna序列的正义链如seq id no：7所示，其对应互补链的dna序列如seq id no：8所示；所述的sgrna 1
‑
2的dna序列的正义链如seq id no：9所示，其对应互补链的dna序列如seq id no：10所示。
28.再将8条单链的sgrna的dna序列分别经过退火后形成4条靶向保守区不同位点的sgrna的寡核苷酸链；然后将该寡聚核苷酸连入px330质粒载体。所述的4条靶向保守区不同位点的sgrna的寡核苷酸链为：
29.sgrna
‑1‑
1序列：5
‑
caccgcattggccgggaatcgaacc
‑
3；
30.sgrna
‑1‑
1作用位点的序列：5
‑
aaacggttcgattcccggccaatgc
‑
3；
31.sgrna
‑1‑
2序列：5
‑
caccgtgaaccaccaatgcatcttg
‑
3；
32.sgrna
‑1‑
2作用位点的序列：5
‑
aaaccaagatgcattggtggttcac
‑
3；
33.sgrna
‑2‑
1序列：5
‑
caccgattgtcacaaatcctagtag
‑
3；
34.sgrna
‑2‑
1作用位点的序列：5
‑
aaacctactaggatttgtgacaatc
‑
3；
35.sgrna
‑2‑
2序列：5
‑
caccgttaacatcatccctagccct
‑
3；
36.sgrna
‑2‑
2作用位点的序列：5
‑
aaacagggctagggatgatgttaac
‑
3。
37.实施例2、构建敲除hspa6基因部分保守区域的猪胚胎成纤维细胞，评估和筛选sgrna。
38.通过对4条sgrna的表达载体进一步的测序后，进行质粒的大提和质粒的乙醇沉淀，将纯化后一定浓度的四种sgrna的px330的表达载体，通过电穿孔转染的方式引入到猪的胚胎成纤维细胞中，转染后的84小时，提取各组细胞的基因组，然后用特异性的检测突变效率的引物进行pcr反应，将所获得的pcr产物一方面送去测序，用于评估2对不同sgrna切割效率的测序峰图如图2所示，图2中红色部分为pam序列，黑色部分为sgrna 1
‑
1和sgrna 1
‑
2,蓝色部分为sgrna 2
‑
1和sgrna 2
‑
2，虚框中为被敲除序列，其中绿色部分为启动子上的一段保守区域。
39.通过分析初步评估每对sgrna的切割效率，从图2的测序峰图中可以看出sgrna 1
‑
1和sgrna 1
‑
2这对序列并不能有效敲除基因保守区域，而sgrna 2
‑
1和sgrna 2
‑
2有效敲除了基因保守区域，因此选择sgrna 2
‑
1和sgrna 2
‑
2作为后续实验的一对sgrna序列。
40.实施例3、px330质粒的转染。
41.复苏基于猪hspa6的传感器细胞系，传代2
‑
3次，然后用pbs洗2～3遍后消化该细胞，离心沉淀细胞后弃上清，加入电转染缓冲液，然后将两种px330质粒按比例加入到细胞和缓冲液中，用移液器轻轻混匀后，轻轻的将混合液移入电极杯中，将电极杯放到电穿孔仪器上进行电击操作。电击完成后，将电极杯在室温静置10分钟后，将电极杯中的混合液转入细胞培养皿中。最后将该细胞培养皿置于37℃二氧化碳培养箱中培养。培养12小时后，换液。
42.实施例4、阳性克隆的筛选与鉴定
43.电转染48h后，通过极限稀释的方法将基于猪hspa6的传感器细胞系铺到100mm细
胞培养皿中，2～3天更换一次细胞培养液。9～10天后待细胞克隆长成后，将细胞放在42℃的细胞培养箱中进行热刺激处理1h，然后放在37℃的培养箱中适应1h后，接着在荧光显微镜下将与wt细胞发光强弱不同的细胞克隆统一做上标记，然后将这些标记过的克隆挑取入24孔细胞培养板中接着培养。2～3天后，待24孔板中的细胞长至一定得汇合度，对细胞进行传代同时分出部分克隆的细胞，将这些细胞用np40裂解液裂解后再通过pcr和测序的方法进一步克隆鉴定及验证定点egfp的整合事件。
44.从阳性细胞克隆鉴定的电泳图3可以看出，wt细胞的序列为624bp，而经过敲除后得到阳性克隆的序列为438bp。其中克隆细胞a1为纯合子，a2、a3、b1和c1为杂合子。
45.对这五种克隆细胞进行测序后得到图4。如图所示，蓝色部分为sgrna序列，红色部分为pam序列。红色箭头所指为切割位置。从图中可以看出，相比wt的序列，五种克隆细胞的序列都对保守区域进行了敲除。
46.图5为egfp定点整合的细胞克隆的pcr鉴定电泳图，从图5中可以看出wt细胞和五种克隆细胞均有egfp基因的敲入，可用于后续荧光分析。
47.实施例4保守区对猪hspa6基因表达的调节功能的研究
48.对细胞克隆a1、a3、b1进行42℃加热刺激处理，刺激实验的结果如图6所示，在对保守区敲除之后，荧光强度有不同程度的变弱。通过q
‑
pcr对结果进一步定量分析，发现在mrna水平上，一些阳性克隆的hspa6及egfp的表达水平有了极显著性的下降。
49.图6包括wt和三种克隆的荧光分析图和实时定量图，根据图3的基因型将5种克隆分为3类，以a1、a3和b1为例。从图6的荧光图中可以看出3种克隆细胞的荧光强度明显弱于wt细胞。从实时定量图可以看出，42℃加热后wt和3种克隆细胞的hspa6基因表达量分别为4569.12、239.02、2560.81、1345.26。相比于wt的表达量，3种克隆的表达量分别降低了94.44％、43.95％、70.56％。经过统计学分析，其p值分别为0.001、0.024、0.004。因此，a3可显著性降低hspa6基因的表达量，而a1和b1极显著性降低hspa6基因的表达量。而egfp基因有和hspa6基因相似的表达模式。
50.对加热处理后阳性克隆hspa6及egfp的mrna表达量分析可，从图7以看出，在37℃时，wt和3种克隆细胞的表达量无显著性差异，与a2有显著性差异(p＝0.02)；与c1有极显著性差异(p＝0.0001)。虽然表达量有差异，但相差倍数在5倍以内，因此可看作在37℃时，细胞之间无表达差异且hspa6基因基本无表达。而在42℃加热后，wt和5种细胞的hspa6基因mrna表达量均有上升。相比于wt细胞hspa6基因的表达量，a1、a2、a3、b1和c1的下降比例分别为94.44％、52.55％、43.95％、70.56％、99.28％。egfp和hsap6基因mrna表达量有相同的表达模式。
51.在敲除了hspa6基因启动子上的一段保守区域以后，该基因的mrna表达量有极显著性降低，可推断该保守区域对hspa6基因的表达有重要调控作用。