一种复合酵母冻干保护剂的制作方法

1.本发明属于食品加工技术领域，特别涉及一种复合酵母冻干保护剂。


背景技术：

2.真空冷冻干燥是将物料冻结到共晶点温度以下，然后在低压状态下，通过升华除去物料中水分的一种干燥方法。冷冻干燥是先将物料中的水分先从液态转变为固态，之后再从固态转化为气态的过程，从而实现物料的干燥过程。在这个过程中菌体会受到冷冻和干燥两个过程的刺激，不可避免的会受到损伤，添加保护剂可以有效地减少菌体在这两个过程中受到的损伤。从渗透方面来说，保护剂可以分为可渗透型保护剂和非渗透型保护剂，其中渗透型保护剂通过进入细胞内部与水结合发生水合反应，从而减少胞内冰晶的生成；而非渗透性保护剂是通过附着在细胞外部，提高保护体系的粘度，从而降低在冻干过程中对细胞的机械性损伤。对于菌体来讲，需要添加保护剂来减少其在这两个过程中受到的损伤，从而提高菌体的存活率。宋志远研究采用脱脂乳粉5％、甘露醇4％、抗坏血酸钠3％作为果蔬生防酵母菌株的冻干保护剂，存活率达到83.64％。周秋阳等研究表明山梨醇5.43g/100ml、海藻糖12.45g/100ml、谷氨酸钠13.56g/100ml时，组合保护效果最好，酵母菌存活率可达84.21％
±
0.87％。王华等采用蔗糖14.15g/100ml、l
‑
谷氨酸钠7.07g/100ml、聚乙二醇1.10g/100ml作为热带假丝酵母菌冻干保护剂时，冻干存活率为82.73％。cahnyuan研究表明类人胶原蛋白1.23％、海藻糖11.50％、甘油4.65％作为双歧杆菌冻干保护剂时，冻干存活率为88.23％。shu研究表明以海藻糖13％、na2hpo40.33％、乳糖7.5％、脱脂乳粉21％配比的复合低温保护剂，冻干嗜酸乳杆菌的存活率为(93.9
±
0.12)％。开发新的酵母保护剂对于冷冻酵母的保护十分必要。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种新型的复合酵母冻干保护剂，对于冷冻过程中的酵母进行有效的保护，提高其存活率。
4.本发明采用的技术方案如下：
5.一种复合酵母冻干保护剂，所述冻干保护剂由植物源的β
‑
葡聚糖、γ
‑
聚谷氨酸、甘露醇复合构成。
6.进一步，所述冻干保护剂的质量份组成如下：β
‑
葡聚糖6
‑
7份、γ
‑
聚谷氨酸0.1
‑
0.2份、甘露醇1
‑
1.3份。
7.优选的，所述冻干保护剂的质量份组成如下：β
‑
葡聚糖6.56份、γ
‑
聚谷氨酸0.15％、甘露醇1.15份。
8.植物源的β
‑
葡聚糖优选为燕麦β
‑
葡聚糖和/或大麦β
‑
葡聚糖。
9.所述酵母优选为酿酒酵母。
10.本发明通过研究发现，β
‑
葡聚糖的添加，可以维持酵母细胞膜的稳定性和提高酵母细胞内抗氧化酶活性以及增加胞内海藻糖的含量，从而提高酵母细胞的存活率。γ
‑
聚谷
氨酸作为大分子化合物能够以“包裹”的方式来保护细胞，甘露醇作为小分子主要通过形成无定型结构来保护蛋白质免于聚集，无定型结构的甘露醇会促进蛋白质的稳定。大分子化合物在保护细胞的同时还可以促进小分子化合物对细胞作用的效果。但需要注意的是，当甘露醇添加量高于一定值时，形成的晶体结构对于蛋白质不但没有保护作用，甚至还会促进水分子对细胞的破坏。
11.本发明与现有技术相比，具有如下优点：
12.本发明提供了一种新型的酵母冻干保护剂，能有效地减少菌体在冷冻干燥过程中受到的损伤，提高酵母的存活率。
附图说明
13.图1为酿酒酵母菌冻干后菌细胞形态，其中a为空白组，b为添加复合保护剂组。
具体实施方式
14.以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
15.实施例1
16.酵母冻干保护剂，其质量份组成如下：β
‑
葡聚糖6份，γ
‑
聚谷氨酸0.17份，甘露醇1份。使用时将其按照相应的份数混合后配制成水溶液，其中，β
‑
葡聚糖的质量百分浓度为6％。
17.将其用于后续的酿酒酵母冻干保护，对应的酵母存活率为87.96％。将其用于后续的毕赤酵母(pichia kudriavzevii ifm 53500)冻干保护，冻干后存活率为82.50％，用于异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus isolate mdy2)冻干保护，相应的存活率为81.68％。但上述三种酵母的空白对照组(未添加保护剂组)的存活率都仅为3％～4％。
18.实施例2
19.酵母冻干保护剂，其质量份组成如下：β
‑
葡聚糖6.56份，γ
‑
聚谷氨酸0.15份，甘露醇1.15份。使用时将其按照相应的份数混合后配制成水溶液，其中，β
‑
葡聚糖的质量百分浓度为6.56％。
20.将其用于后续的酿酒酵母保护，对应的酵母存活率为90.69％。将其用于后续的毕赤酵母(pichia kudriavzevii ifm 53500)冻干保护，冻干后存活率为85.17％，用于异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus isolate mdy2)冻干保护，相应的存活率为83.45％。
21.对比例1
22.酵母冻干保护剂，配制成水溶液，每100g中含有脱脂乳粉5g、甘露醇4g、抗坏血酸3g，其余为无菌蒸馏水。将其用于后续的酿酒酵母保护，对应的酵母存活率为80.8％。
23.对比例2
24.酵母冻干保护剂，按照100ml计，其中含有海藻糖12.45g、谷氨酸钠13.56g、山梨醇5.43g，其余为无菌蒸馏水。将其用于后续的酿酒酵母保护，对应的酵母存活率为73.77％。
25.对比例3
26.酵母冻干保护剂，按照100ml计，其中含有聚乙二醇1.10g、l
‑
谷氨酸钠7.07g、蔗糖14.15g，其余为无菌蒸馏水。
27.将其用于后续的酿酒酵母保护，对应的酵母存活率为72.77％。
28.对比例4
29.酵母冻干保护剂，为β
‑
葡聚糖的质量百分浓度为6％的蒸馏水溶液。将其用于后续的酿酒酵母保护，对应的酵母存活率为36.78％。
30.对比例5
31.酵母冻干保护剂，为γ
‑
聚谷氨酸的质量百分浓度为0.17％的蒸馏水溶液。将其用于后续的酿酒酵母保护，对应的酵母存活率为36.03％。
32.对比例6
33.酵母冻干保护剂，为甘露醇的质量百分浓度为1％的蒸馏水溶液。将其用于后续的酿酒酵母保护，对应的酵母存活率为37.12％。
34.对比例7
35.酵母冻干保护剂，为β
‑
葡聚糖与γ
‑
聚谷氨酸溶于蒸馏水中的溶液，β
‑
葡聚糖的质量百分浓度为6％，γ
‑
聚谷氨酸的质量百分浓度为0.17％。将其用于后续的酿酒酵母保护，对应的酵母存活率为67.07％。
36.对比例8
37.酵母冻干保护剂，为β
‑
葡聚糖与甘露醇溶于蒸馏水中的溶液，β
‑
葡聚糖的质量百分浓度为6％，甘露醇的质量百分浓度为1％。将其用于后续的酿酒酵母保护，对应的酵母存活率为69.52％。
38.对比例9
39.酵母冻干保护剂，为甘露醇与γ
‑
聚谷氨酸溶于蒸馏水中的溶液，γ
‑
聚谷氨酸的质量百分浓度为0.17％，甘露醇的质量百分浓度为1％。将其用于后续的酿酒酵母保护，对应的酵母存活率为65.91％。
40.对比例10
‑
17
41.酵母冻干保护剂，为β
‑
葡聚糖、甘露醇与γ
‑
聚谷氨酸溶于蒸馏水中的溶液，三者的质量百分浓度如下表所示。将其用于后续的酿酒酵母保护，对应的酵母存活率详见下表。
[0042][0043][0044]
可见，上述对比例的复合冻干保护剂不如本发明复合冻干保护剂对于酿酒酵母的保护效果好。
[0045]
采用下列方法评价实施例以及对比例的保护剂的效果。
[0046]
实验方法
[0047]
1、真空冷冻干燥工艺
[0048]
以加入无菌水的酵母体系为空白对照组，以加入不同实施例和对比例的保护剂溶
液的酵母体系为处理组。
[0049]
所述的酵母体系通过下法获得：
[0050]
1)酿酒酵母
[0051]
取适量安琪酵母股份有限公司生产的安琪高活性干酵母溶解于无菌水中，利用稀释涂布平板法涂布于ypd固体培养基，37℃培养48h，挑取单菌落于ypd液体培养基中扩大培养，培养20h后离心即可取得菌泥。
[0052]
2)异常威克汉姆酵母以及毕赤酵母的获得
[0053]
称取10g老酵面团样品(酵子型老酵面团，取样于河南西部山区和平原地区)，在超净工作台中加入100ml灭菌蒸馏水，无菌均质器均质2分钟，吸取悬浮液进行十倍梯度稀释，取0.1ml涂布平板。分别在酵母菌分离培养的ypd培养基中添加50mg/l的氯霉素和50mg/l的氨苄青霉素，分别置于恒温恒湿培养箱中30℃培养48h。每个样品选取菌落数在50～200的平板，从中随机挑取15个单菌落在ypd液体培养基中30℃，150rpm/min振荡培养15h进一步活化培养，利用dna测序鉴定得到异常威克汉姆酵母和毕赤酵母。之后将异常威克汉姆酵母和毕赤酵母分别接种到ypd液体培养基中扩大培养，培养20h后离心获得相应的菌泥。
[0054]
将相应的酵母菌泥与无菌水或保护剂溶液按照质量比例为1:2混合，30℃恒温箱中平衡60min，之后于
‑
18℃冰箱中预冻8h，预冻结束后迅速放入真空冷冻干燥机中，于冷阱温度
‑
75℃，真空度145～155mtoor条件下冻干20h，获得酵母冻干粉。
[0055]
2、冻干后酵母菌存活率的计算
[0056]
将前述步骤获得的酵母冻干粉用体积浓度为0.85％的无菌生理盐水复水至冻干前体积，溶解之后放入30℃恒温培养箱中活化30min，利用美兰染色法测定酵母冻干存活率，存活率计算公式如下：
[0057][0058]
3、微观结构观察
[0059]
通过图1可以直观地观察到冻干对酿酒酵母菌细胞的损伤以及保护剂的作用。其中，未添加保护剂组部分细胞变形、破裂(图1a中箭头表示)，其对应的酵母冻干后存活率仅为3％。添加复合保护剂组(图1b，对应实施例2)菌体形态完整、细胞饱满，酵母冻干存活率可达到90.69％。该结果表明，冻干
‑
再水化过程破坏了酵母菌细胞膜完整性，本发明的复合保护剂能很好的维持冻干菌体细胞膜的渗透屏障和结构完整性，避免细胞内容物泄漏，实现对酵母菌的冻干保护。