一种基于焦磷酸测序技术的AHRR基因甲基化检测引物及试剂盒的制作方法

一种基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测引物及试剂盒
技术领域
1.本发明属于甲基化检测技术领域，具体涉及一种基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测引物及试剂盒。


背景技术：

2.据统计，全球每年有近600万人死于吸烟引起的相关健康损害，吸烟者患冠状动脉疾病、外周血管疾病、慢性阻塞性肺病、中风等疾病的几率更高。不论是主动吸烟还是被动吸烟，都很容易导致心血管事件的发生。烟草烟雾中已鉴定出的化学物质高达7000多种，其中有69种是已知的人类致癌物(包括多环芳烃)。吸烟能影响动脉粥样硬化的各个阶段，从内皮功能障碍到以血栓性为主的急性临床事件都能受到吸烟的影响；吸烟引起还能血小板和巨噬细胞粘附性增加，从而刺激促凝剂和炎症环境的形成。因此，通过对吸烟驱动心血管疾病发展的分子机制进行解码，深入了解吸烟潜在危害的可能机制对提出相关健康损害的预防和治疗新策略具有重要的意义。
3.dna甲基化是表观遗传调控中的一种重要修饰方式，dna甲基化是表观遗传调控中重要的修饰方式之一，与基因调控、生物发育以及疾病的发生密切相关。dna甲基化主要是指在dna甲基化转移酶(dnmts)的催化下，cpg(胞嘧啶
‑
磷酸
‑
鸟嘌呤)二核苷酸序列内的5’胞嘧啶被甲基共价取代的过程。dna甲基化是由dna甲基转移酶(dnmts)和dna去甲基化酶共同参与调控的过程，并且可以随细胞分裂而遗传给子代，在基因表达调控、染色体稳定和亲本印记中发挥着重要的作用。dna甲基化可以通过改变染色质结构并抑制转录因子和辅因子与相应靶位点的结合而抑制基因的转录，从而降低基因的表达水平。这种dna修饰方式在不改变dna序列的前提下，对基因的表达进行调控，在维持细胞的正常功能、胚胎的发育生长和人类肿瘤的发生中起着重要的作用。
4.表观遗传学修饰还可作为生物标志物，既能反映环境暴露的情况，又能预测疾病的发病风险。全基因组关联性研究揭示吸烟与芳基碳氢化合物受体阻遏物(ahrr)的dna甲基化水平变化关系最为显著，即使戒烟后，这种变化也仅是小部分可逆，因此它可以作为判断是否吸烟的指标。此外，吸烟还与人肺和淋巴细胞中的ahrr(mrna)表达水平升高有关，并且有大量研究都指出ahrr的甲基化与肺癌也有相关性。ahr信号转导通路在许多化合物和环境污染物的代谢中具有重要的作用，ahrr编码的芳香烃受体(ahr)抑制因子可使细胞色素(如cyp1a1/cyp1b1)等基因表达异常，进而阻碍外源性有害物质在机体内的生物转化过程。相比于不吸烟者，吸烟者肺组织中ahrr的甲基化水平较低(p<0.001)，而基因表达水平较高(p＝0.0047)。因此，dna甲基化的改变不仅可能反应了吸烟的暴露效应，也可能是吸烟引起相关疾病的潜在机制之一。
5.由此可见，ahrr甲基化的程度可能提供超出现有风险预测模型的有价值信息，通过检测ahrr基因的dna甲基化水平从而判断由吸烟引起的肺癌患者的预后指标以及相关疾病的发生风险，对指导临床合理用药、实现个体化用药以及肺癌的早期诊断具有重要的意
义。因此，开发一种简便、快速、低成本的ahrr基因甲基化检测方法具有重要的应用价值。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测引物，由该检测引物制备得到的ahrr基因甲基化试剂盒，在ahrr基因甲基化的检测过程中具有简便、快速、低成本、针对性强、检测准确率高等优势。
7.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
8.本发明提供了一种基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测引物，包括扩增ahrr基因所需测序片段的特异性扩增引物ahrr
‑
f和ahrr
‑
r以及与ahrr基因所需测序片段相匹配的测序引物ahrr
‑
s，所述ahrr
‑
f、ahrr
‑
r和ahrr
‑
s的核苷酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示。
9.优选地，所述ahrr基因为人源ahrr基因。具体地，所述ahrr基因为人的ncbi发布版本37基因组序列的第5条染色体上的核苷酸片段(chr5:321714
‑
438285)。
10.优选地，所述甲基化检测引物检测的cpg位点为ahrr基因的cg05575921位点(chr5:373378)。
11.本发明还提供了上述的基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测引物在制备ahrr基因甲基化检测产品中的应用。
12.本发明还提供了一种基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测试剂盒，该试剂盒包括上述的基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测引物。
13.本发明提供的基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测试剂盒，首先利用重亚硫酸盐转化的方式，将未甲基化的胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)，而甲基化的胞嘧啶(c)则保持不变，经过扩增引物的扩增后产生具有c/t单碱基差异的扩增产物，从而达到区分同一个位点的胞嘧啶(c)上不同的甲基化情况的目的。再利用焦磷酸测序技术实现对目标位点的定量检测，根据所测结果的c/t的比例从而获得原始单位点的甲基化率，具有简便、快速、低成本等优势。
14.本发明检测方便、针对性强、检测准确率高，可用于检测心血管疾病以及肺癌等与吸烟相关疾病的ahrr基因甲基化程度。其中ahrr基因cpg位点甲基化水平与吸烟呈负相关，对冠心病患者的预后存在影响，与肺癌早期发病也呈负相关，可通过对样品dna甲基化水平的测定来辅助早期诊断肺癌及心血管疾病。本发明的试剂盒可以方便快捷地从分子水平上为评估心血管疾病、肺癌等与吸烟相关疾病的潜在可能性提供有效的检测手段和依据，具有广阔的应用前景。
15.优选地，所述试剂盒还包括扩增ahrr基因测序片段的试剂和焦磷酸测序试剂。
16.进一步地，扩增ahrr基因测序片段的试剂包括预混液2
×
mix，所述2
×
mix含有氯化镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物和dna聚合酶。
17.进一步地，焦磷酸测序试剂包括磁珠、焦磷酸测序结合缓冲液、焦磷酸测序退火缓冲液、焦磷酸测序变性缓冲液、焦磷酸测序洗脱缓冲液、焦磷酸测序底物、焦磷酸测序酶体系、四种dntp。
18.优选地，所述试剂盒的pcr反应体系为25μl，包括2
×
mix 12.5μl，ahrr
‑
f 2μl，ahrr
‑
r2μl，dna50
‑
100ng。
19.具体地，ahrr
‑
f和ahrr
‑
r的浓度为5μm。
20.优选地，所述试剂盒的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30sec，60℃退火50sec，72℃延伸15sec，共50个循环；72℃延伸5min。
21.本发明还提供了上述的基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测试剂盒在检测ahrr基因甲基化中的使用方法，包括以下步骤：
22.1)提取样本中的dna；
23.2)对提取的dna进行重亚硫酸盐转化；
24.3)以经过步骤2)处理过后的样本dna为模板，使用ahrr基因特异性扩增引物ahrr
‑
f和ahrr
‑
r进行pcr扩增；
25.4)使用ahrr基因甲基化测序引物ahrr
‑
s对步骤3)得到的扩增产物进行焦磷酸测序，从而获得ahrr基因测序片段中cpg位点的甲基化状态。
26.优选地，所述样本选自人血液、细胞或组织样本。
27.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
28.本发明提供了一种基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测引物，可以扩增获得包含甲基化，且与ahrr基因表达水平显著相关的cpg位点；将该检测引物制备成基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化试剂盒，可以简便、快速、低成本的检测ahrr基因的甲基化，从而实现了ahrr基因甲基化水平的精准评估。该试剂盒可以有效地检测吸烟相关ahrr基因的cg05575921位点的甲基化，从而获得待测样本的相关基因的甲基化程度，有利于对心血管及肺癌等与吸烟相关疾病的发生风险程度做出判断。本发明检测方便、针对性强、检测准确率高，可以方便快捷地从分子水平上为评估心血管及肺癌等与吸烟相关疾病的潜在可能性提供有效的检测手段和依据，具有广阔的应用前景。
附图说明
29.图1为ahrr基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图【m为marker(thermo fisher scientific,sm0332)，泳道1、2、3为扩增后的样品，泳道4为不加dna的空白对照】；
30.图2为ahrr基因甲基化的焦磷酸测序结果。
31.图2中，各位点的峰值为该位点的荧光值，目标位点是测序顺序的第4位，因该位点前两位是t，因此该位点的非甲基化的结果与前两位的t结果叠加，该位点的甲基化计算方式为c/[(c t t)/3]。
具体实施方式
[0032]
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0033]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
[0034]
实施例1基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测试剂盒的建立
[0035]
(1)试剂盒的组成：主要包括以下组分：
[0036]
1)扩增ahrr基因的特异性引物ahrr
‑
f和ahrr
‑
r，所需扩增的测序片段为ahrr基因
的g05575921位点；检测ahrr基因甲基化测序引物ahrr
‑
s，与ahrr基因所需测序片段相匹配。
[0037]
上述扩增引物和测序引物为采用pyromark assay design 2.0软件(qiagen)根据ahrr基因的g05575921目标位点设计得到，其序列如下：
[0038]
扩增引物：
[0039]
ahrr
‑
f：5
’‑
biotin
‑
ggattgtttatttttgagagggtagt
‑3’
(5’端带有生物素biotin标记)；
[0040]
ahrr
‑
r：5
’‑
aaaaaaaccctaccaaaaccactc
‑3’
。
[0041]
测序引物：
[0042]
ahrr
‑
s：5
’‑
ggttttggttttgttttgta
‑3’
。
[0043]
2)扩增ahrr基因目标区域(g05575921位点)的试剂：介导扩增反应所需的预混液2
×
mix(含氯化镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物和dna聚合酶等)。
[0044]
3)检测ahrr基因目标位点甲基化的试剂：磁珠、焦磷酸测序结合缓冲液、焦磷酸测序退火缓冲液、焦磷酸测序变性缓冲液、焦磷酸测序洗脱缓冲液、焦磷酸测序底物、焦磷酸测序酶体系、四种dntp。
[0045]
(2)扩增体系和程序的优化：
[0046]
1)扩增体系的优化：试剂盒的pcr反应体系为25μl，其中2
×
master mix(thermo fisher scientific,no.4371355)加入12.5μl，梯度设置扩增引物(浓度为5μm)的投入量，具体为0.5μl、1μl、1.5μl、2μl、2.5μl，dna的投入量为50
‑
100ng，用无酶水将整个体系补足至25μl。根据扩增的产物条带有无或亮度大小，最终确定扩增引物的最佳投入量为2μl。
[0047]
2)扩增程序的优化：该过程主要对退火温度及延伸时间进行了优化。根据扩增引物设计时软件给出的tim值，将pcr过程的退火温度进行梯度优化，分别为54℃、56℃、58℃、60℃、62℃(延伸时间固定)。之后，将延伸时间分别设计为11sec、13sec、15sec、17sec、19sec。经过多次实验优化后，最终确定最佳的退火温度为60℃，延伸时间为15sec。
[0048]
最后将扩增程序确定为：95℃预变性10min；95℃变性30sec；60℃退火50sec；72℃延伸15sec；共50个循环；72℃延伸5min。
[0049]
实施例2基于焦磷酸测序技术的ahrr基因甲基化检测试剂盒的应用
[0050]
(1)血细胞dna提取(tianamp genomic dna kit，dp304)
[0051]
1)取200μl新鲜或冷冻的人血液标本(由从广东省人民医院确诊为冠心病的志愿者提供)，不足200μl可加缓冲液ga补足。
[0052]
2)加入20μl proteinase k溶液，混匀。
[0053]
3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，使溶液变清亮，并简短离心以去除管内壁的水珠。
[0054]
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0055]
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。
[0056]
6)向吸附柱中加入500μl缓冲液gd，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。
[0057]
7)向吸附柱中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。
[0058]
8)重复操作步骤7。
[0059]
9)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0060]
10)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50
‑
200μl洗脱缓冲液te，室温放置2
‑
5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，提取得到dna。
[0061]
对所提取的dna的浓度和纯度进行测定，取质量为：1.8≤od260/280<2.0且od260/230>2.0的dna样品为质量合格的dna，以备下一步使用。
[0062]
(2)dna重亚硫酸盐转化(ez dna methylation
‑
lightning kit，d5030t)
[0063]
以步骤(1)中提取的并经过检测后质量合格的dna作为样品进行重亚硫酸盐转化，具体方法包括以下步骤：
[0064]
1)取20μl样品(使其中含有的dna总量为1μg,剩余的体积用水补足)。
[0065]
2)加入130μl lighting conversion reagent。
[0066]
3)将上述体系放于pcr仪器中，设置条件为：98℃、8min；54℃、60min；4℃、10min。
[0067]
4)在专用的反应柱中，加入600μl m
‑
binding buffer，并将样品从pcr仪中取出，转移到反应柱中，上下颠倒混匀，于离心机中离心(12000r/s、4℃、30sec)并移除下管中的液体。
[0068]
5)往柱中加入100μl m
‑
wash buffer离心(12000r/s、4℃、30sec)。
[0069]
6)再加入200μl l
‑
desulphonation buffer,室温放置20min后离心(12000r/s、4℃、30sec)。
[0070]
7)加入200μl m
‑
wash buffer并离心(12000r/s、4℃、30sec)，此步骤需重复一次。
[0071]
8)将下管丢弃，把上管放于1.5ml低吸附离心管中，加入10μl m
‑
elution buffer离心(12000r/s、4℃、30sec)洗脱dna之后将下管中的转化产物收集起来。
[0072]
(3)pcr扩增
[0073]
1)按下表配置pcr反应体系(25μl)：
[0074][0075]
2)扩增
[0076]
配制反应体系后按照下列扩增程序进行pcr扩增：
[0077]
95℃、15min；50
×
(95℃、30sec；60℃、50sec；72℃、15sec)；72℃、5min。
[0078]
3)琼脂糖凝胶电泳
[0079]
称取琼脂糖2.5g，用0.5
×
的tbe buffer 100ml加热使其充分溶解。待溶液冷却至
室温后加入10μl专用gel green的染液，摇晃混匀后，倒于事先准备好的制胶槽中，插入梳子，待凝胶完全冷凝成型后，脱模置于电泳装置中。电泳液用0.5
×
的tbe buffer，电泳条件为130v、50min。电泳结束后，将胶置于紫外投射仪下观察电泳结果。
[0080]
如图1所示，样品dna扩增后，在140bp
‑
150bp之间有明显的产物条带(1、2、3泳道)，作为对照的空白组则没有相应的产物条带(4泳道)。
[0081]
(4)ahrr基因甲基化焦磷酸测序
[0082]
焦磷酸测序配套的试剂，包括上述磁珠、焦磷酸测序结合缓冲液、焦磷酸测序变性缓冲液、焦磷酸测序洗脱缓冲液、焦磷酸测序退火缓冲液、焦磷酸测序底物、焦磷酸测序酶体系、四种dntp(datpαs、dttp、dgtp、dctp)，购自湖南新开源菲思特精准医疗科技有限公司(湘长械备20190409号)。
[0083]
1)单链制备
[0084]
①
稀释相应的缓冲液：
[0085]
配制结合缓冲液:结合缓冲液：38μl，微珠：2μl；
[0086]
稀释变性缓冲液(8
×
)：变性液(8
×
):1v，超纯水：7v；
[0087]
稀释洗涤缓冲液(10
×
)：洗涤缓冲液(10x)：1v，超纯水：9v。
[0088]
②
在洁净的ep管中加入结合缓冲液(含微珠)40μl，再向其中加入pcr产物20μl，置于台式振荡器上，1100rpm振荡15min；
[0089]
③
7,000
×
g离心1min；
[0090]
④
向ep管中加入150μl稀释后的洗涤缓冲液，7,000
×
g离心1min(此步骤共操作3次)；
[0091]
⑤
取新的洁净ep管，向ep管中加入退火缓冲液6μl，再加入测序引物ahrr
‑
s 1μl；
[0092]
⑥
取出纯化柱，将纯化柱插入ep管中，向纯化柱中加入22μl稀释后的变性缓冲液工作液，静置5min，7,000
×
g离心1min，ep管收集得到单链产物，弃纯化柱。
[0093]
2)上机测序【实时定量焦磷酸序列分析仪(qiagen gmbh,sfd(i)20113404004)】
[0094]
①
溶解测序酶和测序底物：取出测序酶和测序底物干粉小瓶，分别加入620μl超纯水，室温静置5
‑
10min，期间轻轻转动摇晃小瓶直至完全充分溶解后，分装至pcr管中待用，每管分53μl；
[0095]
②
将ep管中的单链产物转移至测序管中，向每个测序管中加入3μl测序酶和3μl测序底物；
[0096]
③
取一个dntp排管，自圆滑一端向平端依次加入20μl datpαs、20μl dttp、20μl dgtp、20μl dctp。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
[0097]
④
准备清洗水槽：将纯水加入清洗水槽中至没过毛刷，将吸水纸置于清洗水槽的指定位置；
[0098]
⑤
启动电脑，等待出现windows桌面；
[0099]
⑥
打开焦磷酸测序仪电源开关，等待一分钟；
[0100]
⑦
双击运行ilight测序软件，单击“托盘进出”按钮。待托盘移出，将清洗水槽、dntp排管、测序管放入指定位置。再次单击“托盘进出”按钮收回托盘；
[0101]
⑧
单击“新建”按钮。从a
‑
i下拉菜单中选择待测序项目，并输入对应的样本数量；
[0102]
⑨
单击“开始测序”按钮。对照提示对话框认真检查准备工作是否完成后，点击“确
定”按钮，开始测序；
[0103]
⑩
测序结束后软件弹出“结束”对话框，点击“确定”按钮。单击“保存”按钮，可保存测序结果文件。单击“输出报告”按钮，可输出结果(excel格式)。
[0104]
如图2所示，该血液样本在cg05575921位点的甲基化率为：12/[(12 72 0)/3]＝42.9％；成功检测到了该血液样品中的甲基化情况。
[0105]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
[0106]
[0107]