与H7N9禽流感易感性相关的标记物及其应用的制作方法

与h7n9禽流感易感性相关的标记物及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及与h7n9禽流感易感性相关的标记物及其应用。


背景技术：

2.禽流感病毒能够跨过物种屏障并感染人类，其中人畜共患甲型禽流感病毒(iav)感染很少见。研究人员尚未观察到人与人之间禽流感病毒的持续传播，这表明宿主基因起到一定的作用。近十年来，禽流感病毒感染人主要是由h7n9亚型引起的。人畜共患病h7n9病毒已经获得了适应哺乳动物宿主所必需的几个特征，包括改变的ha受体特异性和增强的病毒聚合酶活性。尽管如此，实现禽流感病毒跨物种传播的分子机制仍未完全了解。接触家禽是人感染h7n9的主要风险因素，但职业暴露人群仅占所有病例的7％，表明遗传因素可能在病毒易感性中起作用。
3.随着越来越多的与流感病毒复制相关的宿主因子被发现以及测序技术的发展，通过人群研究，目前已经发现一些与h7n9禽流感易感性或疾病严重程度相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)。其中，干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon induced transmembrane protein 3,ifitm3)备受关注。ifitm3是潜在的甲型流感病毒复制限制因子，与野生型小鼠相比，ifitm 3基因敲除的小鼠感染流感病毒之后，表现出更严重的临床症状。体外研究表明ifitm3 rs12252
‑
c编码n端缺失21个氨基酸的蛋白，该截短蛋白失去其抑制流感病毒复制的功能。研究发现ifitm3 rs12252 cc基因型不但与2009甲型h1n1流感的临床重症相关，并且与人感染h7n9禽流感的严重临床结局相关。ii型跨膜丝氨酸蛋白酶(transmembrane protease serine 2，tmprss2)能促进流感病毒复制，并且tmprss2基因敲除小鼠能抑制甲型流感(h7n9和h1n1)病毒感染。研究人员进一步发现tmprss2的rs2070788g和rs383510t等位基因与人感染h7n9禽流感风险增加相关，同时发现rs2070788gg基因型也与2009年甲型h1n1流感感染重症风险增加相关。而半乳糖凝集素1(lectin galactoside
‑
binding soluble 1，lgals1)则具有抑制流感病毒复制作用，研究人员发现rs4820294/rs2899292gg单倍型与人感染h7n9病毒的保护性相关。进一步功能研究表明，lgals1 rs4820294/rs2899292gg与lgals1在淋巴母细胞系中的高表达相关。另一项51名h7n9病例和224名h1n1pdm09病例共同分析的研究表明，发现ifitm3 rs12252 cc基因型和tlr3 rs5743313cc基因型与更高的死亡风险相关。课题组前期发现ubxn11 rs189256251ct基因型与h7n9感染相关，并且可以降低血清ifn
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α水平；同时也发现3个hla等位基因可能与h7n9易感相关。与禽流感致病力相关的宿主基因如表1所示。
4.表1
[0005][0006]
以往易感基因研究主要关注基因组上常见的高频变异(次等位基因频率(maf)>5％)或低频变异(0.5％<maf<5％)。目前发现的禽流感致病力相关的宿主基因snp，均为通过对人外显子测序数据或已知候选snp基因分型检测数据分析后发现，并缺乏直接的生物学功能验证。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种与h7n9禽流感易感性相关的标记物及其应用，本发明采用病例对照研究方法，从人全基因组水平研究与h7n9禽流感易感性相关的宿主基因，发现人mx1基因编码区的稀有变异与人感染h7n9禽流感风险增加相关。
[0008]
第一方面，本发明提供了一种与h7n9禽流感易感性相关的标记物，人mx1基因编码区上至少存在以下单个稀有变异的标记物，包括物理位置为42804085处存在一个单核苷酸多态性：c>t；或者物理位置为42807807处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42807815处存在一个单核苷酸多态性：a>g；或者物理位置为42807818处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42807836处存在一个单核苷酸多态性：c>t；或者物理位置为42807837处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42807887处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42807900处存在一个单核苷酸多态性：c>t；或者物理位置为
42811623处存在一个单核苷酸多态性：c>a；或者物理位置为42813669处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42813714处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42815794处存在一个单核苷酸多态性：g>c；或者物理位置为42817937处存在一个单核苷酸多态性：c>g；或者物理位置为42817945处存在一个单核苷酸多态性：c>g；或者物理位置为42818000处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42824627处存在一个单核苷酸多态性：t>g；或者物理位置为42824663处存在一个单核苷酸多态性：t>c。
[0009]
本发明通过对罕见变异(maf<0.5％)进行基于基因的关联分析，发现mx1基因与人类h7n9感染的关联最强，h7n9患者的mx1基因中发现了总共17种不同的snv，其maf<0.5％，而在健康家禽工人中没有发现罕见的mx1基因snv，因此，说明上述发生了单核苷酸变异的标记物与人人感染h7n9禽流感风险增加相关。
[0010]
第二方面，与h7n9禽流感易感性相关的标记物的检测引物组，其特征在于，检测引物组的序列包括seq id no:1～seq id no:34所示。
[0011]
第三方面，本发明提供上述的标记物在预测人感染h7n9禽流感病毒易感性中的应用。
[0012]
第四方面，本发明提供检测如上述的标记物的试剂在预测人感染h7n9禽流感病毒易感性中的应用。
[0013]
第五方面，本发明提供检测如上述的标记物的试剂在制备预测人感染h7n9禽流感病毒易感性产品中的应用。
[0014]
更优选地，所述产品包括试剂盒。在此需要说明的是，预测人感染h7n9禽流感病毒易感性产品不仅限于试剂盒，还包括本领域常规使用的产品。
[0015]
第六方面，本发明一种用于检测h7n9禽流感易感性的试剂盒，包括上述的标记物或上述的检测引物。
[0016]
第七方面，本发明提供了一种mxa抗病毒蛋白，人mx1基因编码区上至少存在以下单个稀有变异的蛋白，包括物理位置为42804085处存在一个单核苷酸多态性：c>t；或者物理位置为42807807处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42807815处存在一个单核苷酸多态性：a>g；或者物理位置为42807818处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42807836处存在一个单核苷酸多态性：c>t；或者物理位置为42807837处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42807887处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42807900处存在一个单核苷酸多态性：c>t；或者物理位置为42811623处存在一个单核苷酸多态性：c>a；或者物理位置为42813669处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42813714处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42815794处存在一个单核苷酸多态性：g>c；或者物理位置为42817937处存在一个单核苷酸多态性：c>g；或者物理位置为42817945处存在一个单核苷酸多态性：c>g；或者物理位置为42818000处存在一个单核苷酸多态性：g>a；或者物理位置为42824627处存在一个单核苷酸多态性：t>g；或者物理位置为42824663处存在一个单核苷酸多态性：t>c。
[0017]
上述存在单个稀有变异的mxa抗病毒蛋白在转染的人类细胞系中失去了抑制h7n9、h5n1和h7n7禽流感病毒的能力。上述存在单个稀有变异的mxa抗病毒蛋白对野生型(wt)mxa的抗病毒功能产生显性负效应，表明杂合子携带者中存在mxa无效表型。
[0018]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0019]
本发明利用深度测序技术，对h7n9病例与健康对照进行全基因组测序，通过关联分析发现h7n9感染与mx1基因中稀有单核苷酸变异(snv)之间存在很强的关联。其中有14个mx1基因snv中使mxa完全失去了的抑制h7n9的能力。
附图说明
[0020]
图1为本发明分析流程图；
[0021]
图2为本发明mx1基因snv功能验证图i；
[0022]
图3为本发明mx1基因snv功能验证图ii。
具体实施方式
[0023]
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
[0024]
实施例1、mx1 snv与人类h7n9感染易感性相关联
[0025]
为了鉴定可能使人类易患h7n9感染的基因，本发明对h7n9患者和健康对照人员进行了全基因组测序(wgs)，本发明招募了220名2013年至2017年间实验室确诊的h7n9病例和121名与流行病学相关的健康家禽工人作为对照者，进行高深度wgs(平均测序深度>30
×
)以准确检测稀有变异。
[0026]
根据质量控制标准排除样品后，217名h7n9患者和116名对照者仍待进一步分析。经过严格的数据过滤，我们总共鉴定了1850万个高置信度的常染色体变异，包括1750万个snv和100万个插入缺失多态性(indel)。其中73.36％变异的次要等位基因频率(maf)<5％(低频率和稀有变异)，58.69％的次要等位基因频率(maf)<0.5％(稀有变异)(gnomad数据库v2.1.1；)。基因型检测高度准确，wgs数据与质谱基因分型之间的一致性为99.7％。
[0027]
为了确定h7n9感染的易感基因，本发明进行了多项关联研究。通过对罕见变异(maf<0.5％)进行基于基因的关联分析，发现mx1基因与人类h7n9感染的关联最强(表2)。在21名h7n9患者的mx1基因中发现了总共17种不同的snv(表1)，其maf<0.5％，而在健康家禽工人中没有发现罕见的mx1 snv。检测上述snv引物组的序列包括seq id no:1～seq id no:34所示(表3)。h7n9患者(29.5
×
)和对照(27.4
×
)的mx1外显子的平均测序深度高，以及17个mx1 snv的测序深度至少为29.2
×
，确保了准确识别这些罕见的核苷酸变化。17个snv中有6个是新的，未在单核苷酸多态性数据库(dbsnp)或gnomad中列出。
[0028]
为了验证本发明上述的发现，本发明选择了一个由4,078名汉族人组成的一般人群对照组。确定了分别携带31个稀有杂合mx1 snv的72人，携带率为1.77％(表2)，反映了gnomad中所有东亚人的携带率。将h7n9病例中罕见mx1 snv的流行率与该对照组的流行率进行比较，揭示了mx1 snv与人类h7n9感染易感性增加之间的高度显著关联。对于稀有mx1 snv的携带者，h7n9感染的几率高出5.96倍(表2)。在调整性别后，这种关联仍然非常显著，并得到了来自中国代谢分析项目(chinamap)的10,588个人的全基因组测序数据的证实，该数据用作第二个一般人群对照组。该人群中罕见mx1snv的携带频率为1.23％，也显著低于h7n9病例(表2)。
[0029]
表1
[0030][0031][0032]
注：
[0033]
*dbsnp v154
[0034]
grch37.p10chr 21
[0035]
数据为公开的数据
[0036]
数据来源于中国代谢分析项目(chinamap)
[0037]
表2 carrier frequencies of rare mx1 snvs in h7n9 patients and controls
[0038][0039]
注：*为公开的数据；**来源于中国代谢分析项目(chinamap)。
[0040]
表3
[0041][0042][0043]
*reference sequence grch37.p10 chr 21
[0044]
#coding dna reference sequence(c.):nc_000021.8(nm_001144925.2)。
[0045]
实施例2、mx1基因snv功能验证
[0046]
对上述mx1基因中发现的17种不同的snv进行功能验证。
[0047]
结果发现，在h7n9病例中发现的17个mx1基因snv中有14个使mxa完全失去了的抑制h7n9的能力(图2c、图2d以及图3a)以及禽h5n1和h7n7亚型(图3c和图3d)。这14个mx1基因snv还失去了对人季节性h1n1亚型的抑制作用(图3b)。因此，这些mx1 snv可能赋予不仅对人畜共患病而且对地方性iav感染的易感性增强。
[0048]
h7n9病例中检测到的17个mx1稀有变异(表1)中，除了rs199543737、rs34717738和rs774494290，其余14个snv使mx1编码的mxa抗病毒蛋白完全失去了的抑制h7n9的能力。
[0049]
本发明利用深度测序技术，对h7n9病例与健康对照进行全基因组测序，通过关联分析发现h7n9感染与mx1基因中稀有单核苷酸变异(snv)之间存在很强的关联。mx1编码的mxa抗病毒蛋白是一种干扰素(ifn)诱导的gtp酶，具有抗病毒功能，已知抑制转基因小鼠的高致病禽流感病毒感染。
[0050]
本发明的结果表明，大多数mxa突变体在转染的人类细胞系中失去了抑制h7n9、h5n1和h7n7禽流感病毒的能力。大多数非活性mxa突变体对野生型(wt)mxa的抗病毒功能产生显性负效应，表明杂合子携带者中存在mxa无效表型。本发明为基于mx1的抗病毒防御在控制人类人畜共患病iav感染中的关键作用提供了遗传证据。
[0051]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。