一种胞嘧啶碱基编辑载体及其应用与抗除草剂杨树的创制方法

本发明涉及植物基因工程，尤其涉及一种胞嘧啶碱基编辑载体及其应用与抗除草剂杨树的创制方法。

背景技术：

1、杨树(

populusspp.)是重要的速生用材和生态防护林树种，生长快、适应性强、用途广泛，在木材加工、生态修复及生物质能源等领域应用广泛。杨树常规育种周期长，基因编辑技术为杨树精准性状改良提供了高效途径。

2、crispr/cas碱基编辑技术可在不产生双链断裂的情况下实现单碱基替换，然而该技术在杨树中的应用仍面临以下问题：一是编辑效率偏低，现有报道中杨树碱基编辑效率整体低于主要农作物，难以满足育种需求。二是不同cas9变体与杨树基因型的适配性缺乏系统比较，导致载体选择缺乏依据。三是筛选流程繁琐，编辑事件的鉴定依赖pcr和测序，周期长、通量低，缺少基于荧光报告基因等手段的可视化初筛方法。四是无痕编辑策略有待完善，获得编辑后仍残留外源dna的植株在林木生物安全评估中处于不利地位。

3、此外，现有杨树碱基编辑研究主要集中于84k杨等模式材料，而实际生产中主栽的欧美杨、渤丰3号杨等优良栽培无性系中的研究尚少。由于不同杨树基因型在遗传转化效率、再生能力及编辑响应方面存在明显差异，所以现有得基因编辑工具往往难以直接应用于生产型杨树材料。因此，建立广谱适配杨树良种的高效碱基编辑技术体系，对于推动杨树分子育种具有重要的理论和实践意义。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种胞嘧啶碱基编辑载体及其应用与抗除草剂杨树的创制方法，具体提供了一种杨树良种高效碱基编辑技术体系及其在抗除草剂新种质创制中的应用，通过密码子优化、cas9变体筛选、可视化标记开发和无痕编辑策略的系统整合，构建适配杨树良种的高效碱基编辑技术平台。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种胞嘧啶碱基编辑载体，其包含胞嘧啶脱氨酶的编码序列、cas9突变体的编码序列和尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂的编码序列；所述胞嘧啶脱氨酶的编码序列的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述cas9突变体为zcas9-ngg变体或spcas9-ngg变体，所述zcas9-ngg变体的氨基酸序列如seq id no.9所示，所述spcas9-ngg变体的氨基酸序列如seq id no.11所示；所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂的编码序列的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明中，所述胞嘧啶碱基编辑载体指cbe载体，是携带胞嘧啶碱基编辑系统核心组件的植物表达载体，其t-dna区域内至少包含融合蛋白表达盒，该融合蛋白表达盒编码由胞嘧啶脱氨酶（ferny）、具有单链切口活性的cas9突变体及尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂（dugi）组成的融合蛋白。

5、优选地，所述cas9突变体为zcas9-ngg变体。

6、优选地，所述zcas9-ngg变体的编码序列的核苷酸序列如seq id no.10所示。

7、优选地，所述spcas9-ngg变体的编码序列的核苷酸序列如seq id no.12所示。

8、优选地，所述胞嘧啶碱基编辑载体还包含sgrna盒。

9、sgrna盒用于转录靶向目标位点的grna，其与融合蛋白表达盒在胞嘧啶碱基编辑载体的t-dna上并列排布，转入植物细胞后分别进行转录和翻译，grna与融合蛋白在细胞内组装为效应复合物，引导胞嘧啶脱氨酶在靶位点将特定胞嘧啶（c）脱氨基转变为尿嘧啶（u），经dna修复实现c-to-t或g-to-a的单碱基替换。

10、更优选地，所述sgrna盒包括靶向除草剂抗性相关基因的grna，所述除草剂抗性相关基因选自

als基因、

dtx6基因和

acc基因中的任意一种或多种。

11、进一步优选地，靶向

als基因的grna包括如seq id no.33所示的核苷酸序列。

12、进一步优选地，靶向

dtx6基因的grna包括如seq id no.34所示的核苷酸序列。

13、进一步优选地，靶向

acc基因的grna包括如seq id no.35所示的核苷酸序列。

14、进一步优选地，所述除草剂为磺酰脲类除草剂。

15、更进一步优选地，所述磺酰脲类除草剂为氯磺隆和/或苯磺隆。

16、优选地，所述胞嘧啶碱基编辑载体还包含荧光蛋白的编码序列。

17、更优选地，所述荧光蛋白选自eygfpuv、egfp和mcherry。

18、进一步优选地，所述eygfpuv的编码序列包括如seq id no.24所示的核苷酸序列。

19、优选地，所述胞嘧啶碱基编辑载体以phzm184载体为骨架。

20、第二方面，本发明提供一种重组微生物，其包含任一前述的胞嘧啶碱基编辑载体。

21、优选地，所述重组微生物的底盘菌为大肠杆菌或农杆菌。

22、第三方面，本发明提供前述的胞嘧啶碱基编辑载体或前述重组微生物在杨树的基因编辑、品种改良或种质创制中的应用。

23、优选地，品种改良包括与除草剂抗性相关的杨树品种改良。

24、优选地，种质创制包括与除草剂抗性相关的杨树种质创制。

25、优选地，所述除草剂为磺酰脲类除草剂。

26、更优选地，所述磺酰脲类除草剂为氯磺隆和/或苯磺隆。

27、第四方面，本发明提供一种抗除草剂杨树的创制方法，包括：以碱基编辑载体对杨树进行基因编辑，使得als蛋白存在抗性突变；所述碱基编辑载体包含胞嘧啶碱基编辑载体以及靶向als基因的grna，所述胞嘧啶碱基编辑载体包含胞嘧啶脱氨酶的编码序列、cas9突变体的编码序列和尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂的编码序列；所述胞嘧啶脱氨酶的编码序列的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述cas9突变体为zcas9-ngg变体或spcas9-ngg变体，所述zcas9-ngg变体的氨基酸序列如seq id no.9所示，所述spcas9-ngg变体的氨基酸序列如seq id no.11所示；所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂的编码序列的核苷酸序列如seq idno.2所示；所述抗性突变选自p197s、p197l和r198w中的任意一种或多种。

28、优选地，所述靶向als基因的grna包括如seq id no.33所示的核苷酸序列。

29、优选地，所述胞嘧啶碱基编辑载体还包含荧光蛋白的编码序列。

30、更优选地，所述荧光蛋白选自eygfpuv、egfp和mcherry。

31、进一步优选地，所述eygfpuv的编码序列包括如seq id no.24所示的核苷酸序列。

32、优选地，所述胞嘧啶碱基编辑载体以phzm184载体为骨架。

33、优选地，所述创制方法还包括：以农杆菌介导的叶盘法将所述碱基编辑载体转化至杨树叶片外植体，经磺酰脲类除草剂筛选。使用该除草剂进行筛选，能淘汰未发生编辑的野生型植株。

34、更优选地，所述磺酰脲类除草剂为氯磺隆和苯磺隆。

35、进一步优选地，所述磺酰脲类除草剂为氯磺隆，筛选浓度为100 μg/l。

36、更进一步优选地，所述磺酰脲类除草剂为苯磺隆，筛选浓度为10 mg/l。

37、更优选地，所述创制方法还包括：以核苷酸序列如seq id no.44～seq id no.47所示的引物对筛选所得杨树叶片外植体进行pcr检测。

38、进一步优选地，还对所得pcr产物进行测序。

39、eygfpuv基因与基因编辑工具表达盒串联构建于同一t-dna中，因此，eygfpuv荧光可作为t-dna存在的可视化标记。在农杆菌介导的遗传转化及后续植株再生过程中，不同细胞谱系的t-dna整合状态可能存在差异，部分材料可能形成t-dna整合与未整合细胞共存的嵌合状态。因此，本发明首先利用als靶位点编辑所产生的内源除草剂抗性进行第一轮筛选。在100 μg/l氯磺隆胁迫条件下，未产生有效抗性编辑的材料受到抑制，而具有相应als抗性编辑的细胞能够继续存活并再生，从而富集潜在的目标编辑材料。随后，以eygfpuv为外源t-dna标记，对als抗性材料进行荧光筛选，优先选择eygfpuv阴性的抗性材料，以富集可能已丢失t-dna的编辑株系。最后，通过t-dna边界特异性pcr检测外源t-dna残留情况，并结合目标位点测序鉴定编辑类型，从而筛选获得目标位点发生编辑且未检测到t-dna残留的无痕编辑候选株系。

40、优选地，杨树的品种为84k杨、渤丰3号杨或南林895杨。

41、所述84k杨为

populus alba × p. glandulosa（银白杨 × 腺毛杨）的杂交品种，简写代号为

pag；所述渤丰3号杨为

populus × euramericanacv. ‘bofeng 3’的欧美杨杂交品种，简写代号为

pd；所述南林895杨为

p. deltoides × p. euramericana‘nanlin895’的杂交品种，简写代号为

pt。

42、优选地，所述创制方法制得的杨树在使用浓度不低于2.5mg/l的磺酰脲类除草剂的处理下能正常生长。

43、更优选地，所述创制方法制得的杨树在使用浓度为2.5mg/l～10 mg/l的磺酰脲类除草剂的处理下能正常生长。

44、本发明具有如下有益效果：

45、本发明采用密码子优化的ferny脱氨酶与dugi构建得到cbe载体，有效提升了碱基编辑效率。通过向载体骨架中引入eygfpuv紫外荧光蛋白作为可视化筛选标记，在转化后3～5天即可通过检测荧光信号快速评估载体表达活性，荧光阳性愈伤组织的编辑效率预测准确率达90%以上，显著减少后续分子鉴定的工作量，使筛选周期从传统数周压缩至数天。利用该cbe载体对多个品种杨树进行遗传转化，均成功实现了内源靶基因的精准碱基编辑，赋予转化植株对多种磺酰脲类除草剂的稳定抗性，获得抗除草剂新种质。本发明提供了适用于杨树的高效、普适且精准的碱基编辑工具，对加快开发抗除草剂杨树新品种具有重要应用价值。