一种改良胞嘧啶脱氨酶、包含其的碱基编辑系统及应用的制作方法

本技术属于基因编辑领域，具体地，涉及一种白毛蓝泽菌(

lentzea

albidocapillata)来源的胞嘧啶脱氨酶及其针对鸡基因组的碱基编辑系统。

背景技术：

1、碱基编辑技术是一种可实现单碱基精准替换的基因组编辑工具，常见的胞嘧啶碱基编辑系统(cbe)依赖于将胞嘧啶脱氨酶(如apobec1)与ncas9 (d10a)融合，从而在靶向区域实现c-to-t的无双链断裂突变。该类系统已在哺乳动物细胞和小鼠等模式动物中广泛建立，并表现出良好的编辑效率与应用前景。

2、然而，目前公开的cbe系统大多是基于人源或小鼠细胞环境开发和优化的，其在鸡等非哺乳类细胞中存在明显的适配性问题，具体表现为以下几个方面：(1)编辑效率低下：现有常用胞嘧啶脱氨酶(如rapobec1、pmcda1等)在鸡胚、df-1等鸡源细胞中的c-to-t编辑效率明显下降，难以达到实用水平；(2)表达不稳定或毒性大：部分胞嘧啶脱氨酶在鸡细胞中存在蛋白表达效率低、定位不充分或引发毒性的现象，影响编辑器稳定性；(3)缺乏针对鸡细胞环境优化的元件设计：现有cbe系统未考虑密码子优化、转录调控序列适配等因素，限制了其在鸡细胞内的表达与功能；(4)功能验证案例少、工具缺乏标准化：目前尚无公认的高效适用于鸡基因组编辑的cbe系统，现有研究大多处于初步尝试阶段，缺乏系统性开发和应用示范。

3、因此，鉴于当前鸡源系统中缺乏高效且稳定的碱基编辑工具，丞需开展针对性的研究，以开发出适用于鸡源系统的优质碱基编辑工具。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本技术的目的在于提供一种新型的白毛蓝泽菌(

lentzea albidocapillata)来源的胞嘧啶脱氨酶，将其命名为ch-919t2-cbe，并提供一种基于ch-919t2-cbe的针对鸡基因组的碱基编辑系统。

2、具体来说，本技术涉及如下方面：

3、1. 一种胞嘧啶脱氨酶，其氨基酸序列如seq id no: 1所示。

4、2. 如seq id no: 1所示的氨基酸序列在作为胞嘧啶脱氨酶中的应用。

5、3. 如seq id no: 1所示的氨基酸序列在制备胞嘧啶脱氨酶中的应用。

6、4. 如seq id no: 1所示的氨基酸序列作为胞嘧啶脱氨酶在对鸡基因组进行碱基编辑中的应用。

7、5. 一种碱基编辑融合蛋白，其包含核酸靶向结构域和胞嘧啶脱氨酶结构域；

8、其中，所述胞嘧啶脱氨酶结构域包含至少一个如项1所述的胞嘧啶脱氨酶。

9、6. 根据项5所述的碱基编辑融合蛋白，其中所述核酸靶向结构域为tale、zfp或crispr效应蛋白结构域；

10、优选地，所述核酸靶向结构域为crispr效应蛋白结构域。

11、7. 根据项6所述的碱基编辑融合蛋白，其中所述crispr效应蛋白是cas9、cpf1、cas3、cas8a、cas5、cas8b、cas8c、cas10d、cse1、cse2、csy1、csy2、csy3、gsu0054、cas10、csm2、cmr5、cas10、csx11、csx10、csf1、csn2、cas4、c2c1(cas12b)、c2c3、c2c2、cas12c、cas12d、cas12e、cas12f、cas12g、cas12h、cas12i、cas12j、cas12l、cas12m或其它可用的crispr效应蛋白中的至少一种；

12、优选地，所述crispr效应蛋白是cas9，所述cas9是核酸酶失活的cas9、cas9切口酶或核酸酶活性的cas9。

13、8. 根据项5-7中任一项所述的碱基编辑融合蛋白，其中所述碱基编辑融合蛋白还包含至少一个尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂(ugi)。

14、9. 根据项5-8中任一项所述的碱基编辑融合蛋白，其中所述碱基编辑融合蛋白还包含至少一个核定位序列(nls)。

15、10. 一种针对鸡基因组进行修饰的碱基编辑系统，其包含：

16、如项1所述的胞嘧啶脱氨酶或含有编码所述胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列的表达构建体；或如项5-9中任一项所述的碱基编辑融合蛋白或含有编码所述碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体。

17、11. 根据项10所述的碱基编辑系统，其中所述碱基编辑系统还包含至少一种sgrna或至少一种含有编码所述至少一种sgrna的核苷酸序列的表达构建体；

18、所述至少一种sgrna针对所述鸡基因组中的至少一个靶位点。

19、12. 一种针对鸡基因组进行碱基编辑的方法，其包括将项10或11所述的碱基编辑系统与鸡基因组中的靶位点接触，从而实现对鸡基因组进行碱基编辑。

20、13. 根据项12所述的方法，其中所述碱基编辑系统与所述靶位点接触发挥脱氨作用，导致所述靶位点中的一个或多个核苷酸发生取代；

21、优选地，所述靶位点包含dna序列5’-mcn-3’，所述m为a、t、c或g，所述n为a、t、c或g。

22、14. 根据项12或13所述的方法，其中所述接触在体内或体外进行。

23、15. 一种产生至少一个经修饰的鸡细胞的方法，其包括将项10或11所述的碱基编辑系统导入至少一个鸡细胞，由此导致所述至少一个鸡细胞中靶位点内的一个或多个核苷酸发生取代。

24、16. 一种多核苷酸，其编码如项1所述的胞嘧啶脱氨酶或如项5-9中任一项所述的碱基编辑融合蛋白。

25、17. 一种载体，其包含如项16所述的多核苷酸。

26、18. 一种宿主细胞，其包含如项16所述的多核苷酸或项17所述的载体。

27、19. 一种用于针对鸡基因组进行碱基编辑的试剂或试剂盒，其包含如项1所述的胞嘧啶脱氨酶、如项5-9中任一项所述的碱基编辑融合蛋白或如项10或11所述的碱基编辑系统。

28、20. 一种组合物，其包含如项1所述的胞嘧啶脱氨酶、如项5-9中任一项所述的碱基编辑融合蛋白或如项10或11所述的碱基编辑系统。

29、21. 根据项20所述的组合物，其中所述组合物为药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

30、22. 根据项1所述的胞嘧啶脱氨酶、根据项5-9中任一项所述的碱基编辑融合蛋白或根据项10或11所述的碱基编辑系统在对鸡基因组进行碱基编辑中的应用。

31、23. 根据项1所述的胞嘧啶脱氨酶、根据项5-9中任一项所述的碱基编辑融合蛋白或根据项10或11所述的碱基编辑系统，在制备用于对鸡基因组进行碱基编辑的产品中的应用。

32、24. 根据项1所述的胞嘧啶脱氨酶、根据项5-9中任一项所述的碱基编辑融合蛋白或根据项10或11所述的碱基编辑系统，在制备用于介导鸡基因组进行碱基编辑的试剂中的应用。

33、有益效果：

34、本技术通过生物信息学分析，对来自蛋白质数据库的多种来源的胞嘧啶脱氨酶序列进行挖掘、筛选与序列功能比对，并结合结构预测与功能验证，成功筛选获得一种来源于白毛蓝泽菌(

lentzea albidocapillata)的、适用于鸡细胞且可实现高效c-to-t编辑的胞嘧啶脱氨酶(ch-919t2-cbe)，并构建出具备良好编辑活性与稳定性的cbe系统。

35、相较于现有技术，本技术提供的ch-919t2-cbe有效克服了传统胞嘧啶脱氨酶在禽类细胞中编辑效率低等技术瓶颈，在鸡细胞中展现出显著增强的活性，实现了禽类基因组高效、精准的c-to-t定点编辑，为禽类遗传改良与功能基因研究提供了强有力的关键技术支撑。