一种基于真空农杆菌侵染的桃属内种间杂交种叶片的瞬时表达方法

本申请属于植物分子生物学技术和基因工程，具体涉及一种基于真空农杆菌侵染的桃属内种间杂交种叶片的瞬时表达方法。

背景技术：

1、桃属内种间杂交种具有良好的耐盐碱、抗旱等特性，常作为砧木用于核果类果树的嫁接。农杆菌介导法是目前植物遗传转化中最常用的方法之一，尤其适用于双子叶植物。gv3101是一种常用的农杆菌菌株，含有辅助质粒，适合用于植物转化。

2、目前利用真空侵染实现农杆菌转化在香椿、梅花、杜梨等多种植物体系中应用，但是在桃属内种间杂交种尤其是gf677上还未有系统报道。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种基于真空农杆菌侵染的桃属内种间杂交种叶片的瞬时表达方法，通过优化农杆菌侵染液的浓度、真空侵染时长和共培养天数，获得一种侵染率高且坏死率低的桃属内种间杂交种叶片的瞬时表达方法。

2、本发明提供了一种基于真空农杆菌侵染的桃属内种间杂交种叶片的瞬时表达方法，包括以下步骤：

3、在真空条件下，将含表达目标基因的重组农杆菌的侵染液按照od600为 0.6~1的浓度侵染桃属内种间杂交种叶片10~30min，侵染后的桃属内种间杂交种叶片置于共培养培养基上共培养2~6天。

4、优选的，所述真空条件的压力为-0.01~-0.08mpa。

5、优选的，所述含表达目标基因的重组农杆菌的侵染液的od600为0.8，真空侵染时长为20min，共培养时间为2d；

6、或者共培养时间为2d，真空侵染时长为10min，农杆菌侵染液的od600值为1。

7、优选的，共培养时间为4d，农杆菌侵染液的od600值为0.8，真空侵染时长为10 min或20min。

8、优选的，共培养时长为6d，农杆菌侵染液的od600值为0.8，真空侵染时长为20min或30min。

9、优选的，所述共培养培养基为含30g/l蔗糖和8g/l琼脂的ms培养基。

10、优选的，所述共培养培养基上铺设滤纸。

11、优选的，所述表达目标基因的重组农杆菌的构建方法，将表达目标基因的重组质粒转化至农杆菌感受态中，筛选培养，得到表达目标基因的重组农杆菌；

12、所述表达目标基因的重组质粒的骨架载体为pri201-an；

13、所述筛选培养用培养基为含100 μg/ml卡那霉素和50 μg/ml 利福平的lb培养基。

14、优选的，所述共培养结束后，还包括检测瞬时表达结果；

15、所述检测瞬时表达结果的方法，包括以下至少一种：目标基因的表达水平、蛋白免疫印迹检测和蛋白催化结果检测。

16、优选的，当目标基因为β-葡萄糖苷酸酶编码基因时，所述检测瞬时表达结果的方法为gus染色，观察叶片颜色：当叶片变为蓝色时，说明目标基因在叶片上瞬时表达；否则，目标基因未在叶片上表达。

17、本发明提供了一种基于真空农杆菌侵染的桃属内种间杂交种叶片的瞬时表达方法，在真空条件下，将含表达目标基因的重组农杆菌的侵染液按照od600为0.6~1的浓度侵染桃属内种间杂交种叶片10~30min，侵染后的桃属内种间杂交种叶片置于共培养培养基上共培养2~6天。实验证明侵染液浓度、侵染时间和共培养时间均是影响转基因桃属内种间杂交种叶片侵染率和坏死率的关键因素。可见，本发明提供的方法填补了在桃属内种间杂交种叶片上瞬时表达目标基因的空白，并获得较高的侵染率和较低的坏死率，具有良好的实施性，为后续遗传转化体系的构建提供了基础。

1.一种基于真空农杆菌侵染的桃属内种间杂交种叶片的瞬时表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述瞬时表达方法，其特征在于，所述真空条件的压力为-0.01~-0.08mpa。

3.根据权利要求1所述瞬时表达方法，其特征在于，所述含表达目标基因的重组农杆菌的侵染液的od600值为0.8，真空侵染时长为20min，共培养时间为2d；

4.根据权利要求1所述瞬时表达方法，其特征在于，共培养时间为4d，农杆菌侵染液的od600值为0.8，真空侵染时长为10 min或20min。

5.根据权利要求1所述瞬时表达方法，其特征在于，共培养时长6d，农杆菌侵染液的od600值为0.8，真空侵染时长为20min或30min。

6.根据权利要求1所述瞬时表达方法，其特征在于，所述共培养培养基为含30g/l蔗糖和8g/l琼脂的ms培养基。

7.根据权利要求1所述瞬时表达方法，其特征在于，所述共培养培养基上铺设滤纸。

8.根据权利要求1所述瞬时表达方法，其特征在于，所述表达目标基因的重组农杆菌的构建方法，将表达目标基因的重组质粒转化至农杆菌感受态中，筛选培养，得到表达目标基因的重组农杆菌；

9.根据权利要求1~8中任意一项所述瞬时表达方法，其特征在于，所述共培养结束后，还包括检测瞬时表达结果；

10.根据权利要求9所述瞬时表达方法，其特征在于，当目标基因为β-葡萄糖苷酸酶编码基因时，所述检测瞬时表达结果的方法为gus染色，观察叶片颜色：当叶片变为蓝色时，说明目标基因在叶片上瞬时表达；否则，目标基因未在叶片上表达。