一种利用几夫碱实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法与流程

本发明涉及重组蛋白，具体涉及一种利用几夫碱实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法。

背景技术：

1、真核表达系统是重组糖蛋白药物、结构生物学研究用蛋白制备的主流体系，其表达产物可完成n-糖基化、二硫键配对、蛋白折叠等翻译后修饰，更接近天然蛋白结构与功能。但真核细胞内的n-糖基化修饰为高度异质化过程，同一表达体系、同一批次蛋白会产生man5至man9系列高甘露糖型、杂合型及复杂型糖链，导致重组蛋白存在显著的糖基化不均一问题。

2、糖基化修饰不均一，会使重组蛋白在分子量、电荷、空间构象等方面存在显著差异，直接造成蛋白产物均一性下降，进而影响蛋白的后续分离纯化、理化性质鉴定与结构功能研究。

3、目前，针对糖基化修饰不均一问题的常规改善手段，均难以在温和、简便的条件下实现稳定、高效的糖型均一化。因此，亟需能够有效解决真核表达重组糖蛋白存在的糖基化修饰不均一这一核心问题，获得均一性良好的重组糖蛋白的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种利用几夫碱实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法，以解决现有技术中真核表达重组糖蛋白存在的糖基化修饰不均一的问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用几夫碱（kifunensine）实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法，包括以下步骤：

3、s1、采用糖基化途径未经基因改造的真核表达宿主细胞，使用无血清表达培养基进行悬浮培养；

4、s2、向细胞培养体系中添加几夫碱储液（添加时机为转染前添加），使其终浓度为5-10 μm，轻柔混匀；

5、s3、将目的基因导入宿主细胞，进行悬浮培养以表达重组蛋白；

6、s4、收集细胞培养上清，经纯化获得高均一性（高均一性是指sds-page条带单一无弥散）糖基化重组蛋白；所述高均一性糖基化重组蛋白的n-糖链为以man9glcnac2为主的高甘露糖型。

7、蛋白表达结束后，对于分泌表达蛋白，收集细胞培养上清，通过低速离心去除细胞沉淀与碎片，随后采用亲和层析进行初步纯化，初步纯化后再通过凝胶过滤层析以及离子交换层析进行进一步的精制纯化，最终获得高纯度的重组目的蛋白。

8、对于胞内蛋白，将表达后的细胞悬液于4℃，4000-6000×g离心15~20 min，弃上清，收集细胞沉淀。按1:5-1:10（质量/体积比）加入预冷的裂解缓冲液并添加蛋白酶抑制剂混合物及少量dnase i。

9、采用高压匀质机在冰浴下充分破碎细胞，释放胞内组分。通过离心去除细胞沉淀与碎片，随后采用亲和层析进行初步纯化，初步纯化后再通过凝胶过滤层析以及离子交换层析进行进一步的精制纯化，最终获得高纯度的重组目的蛋白。

10、进一步地，步骤s1所述真核表达宿主细胞为哺乳动物细胞；培养至细胞密度达到2×106 cells/ ml，活率＞95%备用。

11、进一步地，所述哺乳动物细胞为expi293f细胞。

12、进一步地，所述哺乳动物细胞转染后的培养条件为37℃、5% co2、120 rpm，培养时间为48-72 h。

13、进一步地，采用质粒dna与pei转染，pei与质粒dna质量比3:1，室温孵育15 min后逐滴加入细胞。

14、对于哺乳动物细胞表达系统使用转染试剂进行瞬时转染，将构建完成的携带目的蛋白编码基因的真核表达质粒，与转染试剂（如pei转染试剂）按照质量比1:3的比例充分混合，室温条件下孵育15 min，随后将混合液缓慢加入到上述宿主细胞悬液中，完成转染操作。后续于37℃，5%co2，120 rpm下持续培养48-72 h,通过监测细胞直径变化及存活率下降情况确定最佳收获时间。

15、进一步地，步骤s4中纯化采用ni-nta亲和层析、q hp离子交换层析、分子筛层析中的至少一种。

16、进一步地，步骤s4之后还包括endo h酶切步骤，所述endo h的加入量为100 u/μg目的蛋白，于37℃孵育16 h，以去除目的蛋白的高甘露糖型n-糖链。

17、与现有技术相比，本发明提供的一种利用几夫碱实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法，通过在未经基因改造的真核表达宿主细胞培养中添加几夫碱，特异性抑制α-甘露糖苷酶i活性，将蛋白糖基化统一阻断在man9glcnac2高甘露糖型状态，在表达阶段实现糖型均一化调控，简化流程且降低成本，有效消除传统表达体系的糖基化异质性，使蛋白条带清晰单一，同时保留糖链辅助折叠与维持构象的功能，保障蛋白表达量与生物活性，还可兼容endo h高效酶切，显著提升去糖基化效率与产物均一性。

1.一种利用几夫碱实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种利用几夫碱实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法，其特征在于，步骤s1所述真核表达宿主细胞为哺乳动物细胞；培养至细胞密度达到2×106cells/ml，活率＞95%备用。

3.根据权利要求2所述的一种利用几夫碱实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为expi293f细胞。

4.根据权利要求3所述的一种利用几夫碱实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞转染后的培养条件为37℃、5% co2、120 rpm，培养时间为48-72 h。

5.根据权利要求4所述的一种利用几夫碱实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法，其特征在于，采用质粒dna与pei转染，pei与质粒dna质量比3:1，室温孵育15 min后逐滴加入细胞。

6.根据权利要求1所述的一种利用几夫碱实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法，其特征在于，步骤s4中纯化采用ni-nta亲和层析、q hp离子交换层析、分子筛层析中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的一种利用几夫碱实现高均一性糖基化重组蛋白的表达方法，其特征在于，步骤s4之后还包括endo h酶切步骤，所述endo h的加入量为100 u/μg目的蛋白，于37℃孵育16 h，以去除目的蛋白的高甘露糖型n-糖链。