一种多杀性巴氏杆菌侵染永生化牦牛支气管上皮细胞株的气液培养模型构建方法

本发明涉及细胞工程学，更具体的说是涉及一种多杀性巴氏杆菌侵染永生化牦牛支气管上皮细胞株的气液培养模型构建方法。

背景技术：

1、牦牛是青藏高原特有的经济动物之一，常年生活在高寒地区，是典型的耐寒家畜。目前牦牛养殖体系已经做到相当完善，但由于沿用放牧模式，很难落实疫苗的全面接种工作，导致牦牛呼吸道疾病流行，对牦牛养殖经济造成了很大的影响。其中多杀性巴氏杆菌（pasteurellamuiltocida，pm）在多种家畜和野生动物中引起许多具有重要经济意义的疾病，死亡率和发病率都很高，与呼吸系统疾病的发病机制有密切关系。已有多项研究表明多杀性巴氏杆菌感染宿主的发病机制较为复杂，但关于多杀性巴氏杆菌侵袭和与宿主的相互作用机制的研究仍然有限。

2、支气管上皮细胞位于动物机体与外界环境的交界处，在病原微生物进入呼气道时通过分泌各种粘液、免疫调节、纤毛摆动来抑制病原微生物的入侵，对维持牦牛呼吸道稳态具有重要作用，分离和培养牦牛支气管上皮细胞基础上建立细胞感染模型，可为研究病原微生物感染宿主的分子机制及其相互作用奠定基础。对于通过呼吸进入机体的病原微生物导致呼吸道感染机制的研究而言，需要模拟呼吸道上皮细胞体内生长的微环境，将细胞暴露于气溶胶中，通过使用暴露装置将气液界面暴露的方式更贴近体内呼吸道上皮细胞暴露于化合物气溶胶中的状态，因此气液界面培养技术是培养支气管上皮细胞的重要方法。

3、然而支气管上皮细胞培养所需的组织来源有限、细胞存活率低、增殖速度缓慢，缺乏上皮细胞表型分化能力，严重制约长期与系统性的实验研究，研究者利用基因转染等技术，将外源永生化基因（htert、猴肾病毒sv40、人类疱疹病毒、人乳头瘤病毒等）引入猪口腔黏膜上皮细胞、犬细支气管上皮细胞、猪耳、胎儿和肺成纤维细胞、人角膜上皮细胞等细胞中，与靶细胞基因整合并促进表达，使某些传代性能差、增殖速度缓慢和易衰老死亡的细胞无限增殖实现永生化，为生物研究提供了宝贵的试验材料。

4、因此，能否提供一种多杀性巴氏杆菌侵染永生化牦牛支气管上皮细胞株的气液培养模型构建方法，克服上述技术不足，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种多杀性巴氏杆菌侵染永生化牦牛支气管上皮细胞株的气液培养模型构建方法。

2、保藏信息：牦牛支气管上皮细胞sv40t-yak becs，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址，中国，武汉，武汉大学；保藏时间：2026年08月10日；保藏编号为cctcc no：c2026159。

3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种永生化牦牛支气管上皮细胞株，细胞株：牦牛支气管上皮细胞sv40t-yakbecs，保藏编号为：cctcc no：c 2026159。

5、本发明还提供了一种多杀性巴氏杆菌侵染永生化牦牛支气管上皮细胞株的气液培养模型构建方法，包括以下步骤：

6、（1）利用含有sv40t基因的慢病毒感染牦牛支气管上皮细胞，经嘌呤霉素筛选获得永生化牦牛支气管上皮细胞株；

7、（2）将永生化牦牛支气管上皮细胞株接种于transwell聚碳酸酯膜上，进行培养；

8、（3）将多杀性巴氏杆菌菌液接种于ali培养期b培养液混匀沉淀，后吸取菌液至transwell聚碳酯膜上室建立侵染模型。

9、优选的：步骤（1）中慢病毒的最佳moi为100。

10、优选的：步骤（1）中嘌呤霉素筛选的浓度为5 μg/ml。

11、优选的：步骤（2）中培养具体为：待细胞生长至100%融合后，下室更换为ali培养期b培养液，吸去上室培养液，培养14天以上，直至跨膜上皮电阻值达到峰值并保持稳定。

12、优选的：步骤（3）多杀性巴氏杆菌菌液的浓度为1.0×107 cfu/ml。

13、本发明还提供了上述的细胞株或如任一上述方法构建的模型在研究牦牛呼吸道疾病致病机制中的应用。

14、本发明还提供了上述的细胞株或如任一上述方法构建的模型在筛选抗多杀性巴氏杆菌药物或评价药物安全性中的应用。

15、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种多杀性巴氏杆菌侵染永生化牦牛支气管上皮细胞株的气液培养模型构建方法，取得的技术效果为：本发明利用sv40t慢病毒成功构建了1株牦牛支气管上皮细胞单克隆细胞系，且该细胞系具有较强的增殖能力以及分化为成熟支气管上皮细胞的能力。后利用transwell聚碳酯膜建立了支气管上皮细胞气液培养模型，并使用多杀性巴氏杆菌进行侵染建立侵染模型，为后续研究牦牛呼吸道疾病致病机制提供了良好的体外理论模型。

1.一种永生化牦牛支气管上皮细胞株，其特征在于，所述细胞株：牦牛支气管上皮细胞sv40t-yak becs，保藏编号为：cctcc no：c 2026159。

2.一种多杀性巴氏杆菌侵染永生化牦牛支气管上皮细胞株的气液培养模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中慢病毒的最佳moi为100。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述嘌呤霉素筛选的浓度为5 μg/ml。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述培养具体为：待细胞生长至100%融合后，下室更换为ali培养期b培养液，吸去上室培养液，培养14天以上，直至跨膜上皮电阻值达到峰值并保持稳定。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述多杀性巴氏杆菌菌液的浓度为1.0×107 cfu/ml。

7.权利要求1所述的细胞株或如权利要求2-6任一所述方法构建的模型在研究牦牛呼吸道疾病致病机制中的应用。

8.权利要求1所述的细胞株或如权利要求2-6任一所述方法构建的模型在筛选抗多杀性巴氏杆菌药物或评价药物安全性中的应用。