抗RSV抗体或其抗原结合片段与应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及抗rsv抗体或其抗原结合片段与应用。

背景技术：

1、rsv的f蛋白为三聚体结构，通过剧烈的构象变化来介导病毒包膜和宿主细胞的融合。f蛋白有两个构象：活性构象（与宿主细胞融合前的pre-f）；非活性构象（与宿主细胞融合后的post-f）。表位是指bcr/tcr能够识别结合的部位，根据现有的文献公布，pre-f有六个主要的抗原位点（ø、i、ii、iii、iv和v），post-f有四个表位（i、ii、iii和iv），前者抗原性强，但相对不稳定，后者较为稳定，但抗原性不强，这两种构象都已作为候选疫苗进入临床评估程序，pre-f蛋白已被证明能在自然感染或免疫后诱导大多数中和抗体，使其成为疫苗开发的首选抗原。由于位点ø和v只存在于pre-f构象上，其免疫原性更强，也成为了rsv相关治疗用抗体及疫苗开发的重要抗原表位。目前，仅针对pre-f结合的位点只有ø和v，结合他们的抗体分别是d25/am22/5c4和hrsv90；针对pre-f单克隆治疗抗体只适用于新生儿和婴幼儿，不能用于成人，并且无法逃逸rsv其他突变株；针对pre-f预防的疫苗只能用于孕妇和老人，不能用于儿童。

2、因此，本领域迫切需要开发一种全人源的、广谱中和rsv不同突变株的、可适用于全年龄段人群（包括成人、儿童及婴幼儿）的单克隆抗体。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种全人源的、广谱中和rsv不同突变株的、可适用于全年龄段人群（包括成人、儿童及婴幼儿）的单克隆抗体。

2、本发明的另一目的在于鉴定出rsv f蛋白上新的广谱中和表位，不仅为筛选的抗体提供作用靶点，更为未来广谱单克隆抗体药物的研发及跨突变株保护的预防性疫苗设计提供关键的结构基础和表位信息。

3、在本发明第一方面，提供了一种抗rsv抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包括如下的互补决定区cdr：

4、所述重链可变区包括以下互补决定区cdr：

5、seq id no：45所示的hcdr1，

6、seq id no：46所示的hcdr2，和

7、seq id no：47所示的hcdr3；

8、且所述轻链可变区包括以下互补决定区cdr：

9、seq id no：49所示的lcdr1，

10、seq id no：50所示的lcdr2，和

11、seq id no：51所示的lcdr3。

12、在另一优选例中，所述的抗体为人源化抗体。

13、在另一优选例中，所述抗rsv抗体或其抗原结合片段特异性结合rsv f蛋白。

14、在另一优选例中，所述抗rsv抗体或其抗原结合片段特异性结合rsv pre-f蛋白。

15、在另一优选例中，所述抗rsv抗体或其抗原结合片段结合rsv pre-f蛋白上的表位，且所述表位不同于d25、am14、am22和palivizumab所结合的表位。

16、在另一优选例中，所述的抗原结合片段包括fab片段、f（ab’）2片段、fv片段。

17、在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有seq id no：44所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性；和/或所述抗体的轻链可变区含有seq id no：48所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性。

18、在另一优选例中，所述抗rsv抗体或其抗原结合片段具有如seq id no：44所示的重链可变区和如seq id no：48所示的轻链可变区。

19、在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链还包括重链恒定区；所述抗体或其抗原结合片段的轻链还包括轻链恒定区。

20、在另一优选例中，所述的抗体为单链抗体、双链抗体、或抗原结合片段。

21、在另一优选例中，所述的抗体为人源化抗体。

22、在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的。

23、在另一优选例中，所述抗体的重链恒定区的氨基酸序列如seq id no：54所示。

24、在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源的。

25、在另一优选例中，所述抗体的轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no：55所示。

26、在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。

27、在另一优选例中，所述抗体为单克隆抗体。

28、在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。

29、在另一优选例中，所述抗体还包含位于重链可变区和轻链可变区之间的连接肽。

30、在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白具有：

31、（i）本发明的第一方面所述的抗rsv抗体或其抗原结合片段；以及

32、（ii）任选地协助表达和/或纯化的标签序列。

33、在另一优选例中，所述标签包括fc标签、flag标签、6his标签，strep标签、ha标签、或其组合。

34、在另一优选例中，所述的重组蛋白（或多肽）包括融合蛋白。

35、在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

36、在本发明的第三方面，提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明中第一方面所述的抗rsv抗体或其抗原结合片段。

37、在另一优选例中，所述核苷酸分子为dna、rna或cdna。

38、在另一优选例中，所述核酸分子包括如seq id no：52所示的编码所述抗体的重链可变区的核苷酸序列。

39、在另一优选例中，所述核酸分子包括如seq id no：53所示的编码所述抗体的轻链可变区的核苷酸序列。

40、在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第三方面所述的核酸分子。

41、在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

42、在另一优选例中，所述的载体为真核表达载体。

43、在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体，或基因组上整合有本发明第三方面所述的核酸分子。

44、在另一优选例中，所述细胞为真核细胞或原核细胞。

45、在另一优选例中，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

46、在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。

47、在另一优选例中，所述的原核细胞为大肠杆菌。

48、在另一优选例中，所述嵌合抗原受体为抗rsv抗体或其抗原结合片段。

49、在本发明的第六方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物含有：

50、（a）抗体部分，所述抗体部分包含本发明中第一方面所述的抗rsv抗体或其抗原结合片段；和

51、（b）与所述抗体或其抗原结合片段偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、或其组合。

52、在另一优选例中，所述可检测标记物选自下组：

53、(a)放射性同位素，诸如35s、14c、125i、3h和131i。可以将抗体用放射性同位素标记，并且可以使用闪烁计数来测量放射性。

54、(b)荧光标记物，诸如稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺、丽丝胺、藻红蛋白、德克萨斯红和brilliant violettm是可用的。可以使用例如current protocols in immunology(同上)中公开的技术将荧光标记缀合至抗体。荧光可以使用流式细胞仪、成像显微镜或荧光计来定量。

55、(c)各种酶-底物标记是可获得的，酶通常催化发色底物的化学变化，其可以使用各种技术测量。例如，酶可催化底物的颜色变化，其可以用分光光度法测量。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光变化的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应变得被电子激发，以及然后发射可以被测量(例如使用化学发光计)的光或将能量供给荧光受体。酶标记的实例包括萤光素酶类 (例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；萤光素、2 ,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。

56、标记与抗体间接缀合，本领域技术人员将知晓用于实现这一点的各种技术。例如，抗体可以与生物素缀合，并且上述三个宽泛类别标记中的任一种可以与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性地结合抗生物素蛋白，并且因此标记可以以这种间接方式与抗体缀合。

57、在另一优选例中，所述抗体药物偶联物的表达式为：mab-（x-y）n；

58、其中，

59、mab为所述抗rsv抗体或其抗原结合片段；

60、x为连接子；

61、y为偶联部分，所述偶联部分为药物；

62、n为≤8的正整数；

63、所述偶联部分与所述抗rsv抗体或其抗原结合片段通过连接子偶联。

64、在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

65、（i）如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第三方面所述的核酸分子、如本发明第四方面所述的载体、或如本发明第五方面所述的宿主细胞、或如本发明第六方面所述的抗体药物偶联物；以及

66、（ii）药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

67、在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

68、在另一优选例中，所述药物组合物用于制备中和rsv病毒的药物。

69、在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第六方面所述的抗体药物偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；

70、所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中rsv蛋白。

71、在另一优选例中，所述试剂用于预防和/或治疗rsv感染。

72、在另一优选例中，所述试剂用于预防和/或治疗与rsv感染相关的疾病。

73、在本发明的第九方面，提供了如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第六方面所述的抗体药物偶联物或如本发明第七方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗rsv感染的药物中的用途。

74、在本发明的第十方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的抗rsv抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括以下步骤：

75、（a）在表达条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞，从而表达所述抗rsv抗体或其抗原结合片段；

76、（b）分离并纯化（a）所述的抗rsv抗体或其抗原结合片段。

77、在本发明的第十一方面，提供了一种检测样品中rsv蛋白的方法，所述方法包括步骤：

78、（s1）将样品与如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段接触；

79、（s2）检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在rsv蛋白。

80、在另一优选例中，所述样品包括：人或动物组织样品、脱落细胞样品。

81、在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗性的。

82、在另一优选例中，所述方法为体外方法。

83、在另一优选例中，所述方法还包括步骤（3）分析抗体和抗原的亲和力。

84、在本发明的第十二方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片（支撑板）和测试条，所述的测试条含有如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组蛋白、或如本发明第六方面所述的抗体药物偶联物。

85、在另一优选例中，所述的测试条还含有抗原点样区。

86、在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。

87、在本发明的第十三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

88、（1）第一容器，所述第一容器中含有如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；和/或

89、（2）第二容器，所述第二容器中含有与如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段结合的第二抗体；和/或

90、（3）第三容器，所述第三容器中含有细胞裂解试剂；或者，

91、所述试剂盒含有如本发明第十二方面所述的检测板。

92、在另一优选例中，所述第一容器中的抗体带有可检测标记。

93、在另一优选例中，所述第二容器中的抗体带有可检测标记。

94、在本发明的第十四方面，提供了一种治疗rsv感染的方法，包括步骤：给需要治疗的对象施用治疗有效量的本发明第一方面所述的抗rsv抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的重组蛋白、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的抗体药物偶联物、或如本发明第七方面所述的药物组合物。

95、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。