一种抗Ki-67兔单克隆抗体及其制备方法和免疫组化试剂的应用与流程

本发明属于生物医药及免疫检测，具体涉及一种抗ki-67兔单克隆抗体及其制备方法和免疫组化试剂的应用。

背景技术：

1、ki-67（细胞增殖相关抗原）是一种高度磷酸化的核蛋白，严格限定在细胞周期的g1、s、g2和m期表达，而在g0期（静止期）细胞中不表达。因此，ki-67被公认为评估细胞增殖状态的“金标准”标志物，在胃癌、宫颈癌、乳腺癌、神经内分泌肿瘤、淋巴瘤等多种恶性肿瘤的临床病理分子分型、恶性程度分级、预后评估及治疗方案选择中具有不可替代的临床价值。

2、此外，现有抗ki-67抗体在实际应用中还存在工作浓度高（通常稀释比例在1:100至1:200之间）、工业化重组表达产量低、以及在不含动物源血清白蛋白（bsa）的稀释体系中容易发生多聚体聚集、沉淀而导致效价快速衰减等痛点。这些不足严重限制了全自动免疫组化染色平台的高通量应用，且增加了假阴性或假阳性的误诊风险。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种亲和力极高、特异性强、灵敏度高、稳定性强的重组抗ki-67兔单克隆抗体，同时提供其高产量的重组制备方法以及在超高稀释配方下具有极高稳定性的免疫组化试剂盒产品。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抗ki-67兔单克隆抗体，包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包含氨基酸序列为seq id no:1所示的hcdr1、seq id no:2所示的hcdr2和seq id no:3所示的hcdr3；所述的轻链可变区包含氨基酸序列为seq id no:4所示的lcdr1、seq id no:5所示的lcdr2和seq id no:6所示的lcdr3。

3、进一步，所述的重链可变区的氨基酸序列为seq id no:7所示，所述的轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:8所示。

4、进一步，所述的重链可变区和/或轻链可变区在保持核心cdr结合活性的基础上，其框架区（fr区）包含一个或多个氨基酸残基的保守性替换；且所述的抗ki-67兔单克隆抗体结合人ki-67蛋白的平衡解离常数kd小于1×10-10 m。

5、进一步，所述的抗ki-67兔单克隆抗体的重链可变区的编码dna序列为seq id no:9所示的核苷酸序列，所述的轻链可变区的编码dna序列为seq id no:10所示的核苷酸序列。

6、本发明还提供上述抗ki-67兔单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

7、构建同时包含所述重链可变区编码基因和轻链可变区编码基因的重组表达载体，或者分别构建包含所述重链可变区编码基因和轻链可变区编码基因的重链表达载体和轻链表达载体；将所述重组表达载体，或所述重链表达载体和轻链表达载体共同转染至哺乳动物宿主细胞（优选为cho细胞或hek293细胞）中进行真核表达，收集培养上清液并经protein a亲和层析纯化，得到抗ki-67兔单克隆抗体。

8、本发明还提供上述抗ki-67兔单克隆抗体在免疫组织化学染色（ihc）或免疫细胞化学染色（icc）试剂中的应用。

9、本发明进一步提供上述抗ki-67兔单克隆抗体在制备用于检测临床样本中ki-67表达水平的检测生物制品中的应用，所述的临床样本为经福尔马林固定石蜡包埋的组织切片（ffpe）或液基细胞制片的细胞样本。

10、本发明还提供一种ki-67检测试剂盒，其包括所述的抗ki-67兔单克隆抗体、一抗稀释缓冲液、一抗后试剂、hrp酶标二抗、过氧化氢酶封闭液、dab浓缩液、dab缓冲液和苏木素；

11、所述的一抗稀释缓冲液中包含非蛋白类高分子稳定剂（如特定分子量的聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮组合物）且不含任何动物源性血清白蛋白（bsa-free）；所述的抗ki-67兔单克隆抗体在所述一抗稀释缓冲液中的临床工作稀释比例为1:1000至1:5000。

12、与现有技术相比较，本发明的优点在于：

13、首先，在抗体结合性能与染色工艺上实现了颠覆性的突破：通过特定的兔源cdr序列筛选与重组工程化改造，本发明获得的兔单抗对人ki-67表位展现出亚皮摩尔级（sub-pm）的超高亲和力与极强的特异性，在western blot和ihc/icc检测中均能实现细胞核深染且间质背景零着色的理想效果。

14、其次，本发明在体外诊断（ivd）试剂的商业化生产及储运稳定性上具备显著优势。得益于预料不到的超高亲和力，该抗体在1:1000至1:5000的超高稀释比例下依然能够保持完美的显色灵敏度，其消耗量仅为市售常规抗体的几十分之一，大幅压低了工业生产成本。同时，本发明针对兔源抗体易聚集的固有缺陷，创新性地配合了专有的非蛋白类高分子稳定剂体系，赋予了试剂优异的配方稳定性。在37℃的加速老化测试中，该重组兔单抗放置2周依然效价不降，完全满足临床检验对于冷链或常温运输的严苛质控要求。

1.一种抗ki-67兔单克隆抗体，其特征在于：包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的互补决定区序列为seq id no:1所示的hcdr1、seq id no:2所示的hcdr2和seq idno:3所示的hcdr3；所述轻链可变区的互补决定区序列为seq id no:4所示的lcdr1、seq idno:5所示的lcdr2和seq id no:6所示的lcdr3。

2.根据权利要求1所述的一种抗ki-67兔单克隆抗体，其特征在于：所述的重链可变区全长的氨基酸序列为seq id no:7所示，所述的轻链可变区全长的氨基酸序列为seq idno:8所示。

3.根据权利要求2所述的一种抗ki-67兔单克隆抗体，其特征在于：所述的重链可变区的编码dna序列为seq id no:9所示的核苷酸序列，所述的轻链可变区的编码dna序列为seqid no:10所示的核苷酸序列。

4.一种权利要求1-3中任一项所述的抗ki-67兔单克隆抗体在免疫组织化学（ihc）染色和免疫细胞化学(icc)染色试剂中的应用。

5.一种权利要求1-3中任一项所述的抗ki-67兔单克隆抗体在制备ki-67检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂盒包括抗ki-67兔单克隆抗体、一抗后试剂、hrp酶标二抗、过氧化氢酶封闭液、dab浓缩液、dab缓冲液和苏木素。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒中还包括一抗稀释缓冲液，所述的一抗稀释缓冲液中包含非蛋白类高分子稳定剂且不含动物源性血清白蛋白；所述的抗ki-67兔单克隆抗体在所述一抗稀释缓冲液中的工作稀释比例为1:1000至1:5000。