一种缺氧适用型一氧化氮近红外荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于荧光探针检测，具体涉及一种缺氧适用型一氧化氮近红外荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、一氧化氮（no）是生物体内普遍存在的信号分子，在心血管调节、免疫应答、神经传导以及肿瘤的发生发展等众多生理和病理过程中扮演着关键角色。缺氧是实体瘤的典型特征之一，源于肿瘤局部氧消耗与供应之间的失衡。研究表明，缺氧可显著上调肿瘤内no的生成水平——缺氧诱导因子hif-1α可通过上调诱导型一氧化氮合酶（inos）的表达促进no的持续合成；同时，缺氧条件下no可通过酶促或非酶促途径由亚硝酸盐还原产生。no作为缺氧反应中的关键信号分子，通过调节血流改善组织氧合，但肿瘤来源的no亦可通过上调与侵袭、增殖和血管生成相关的基因表达，促进恶性肿瘤的进展。因此，准确检测缺氧肿瘤区域内的no水平，对于肿瘤的精准诊断和机制研究具有重要意义。

2、荧光探针因其高灵敏度、高选择性和实时可视化等优势，已被广泛用于no的检测。目前，no荧光探针主要分为两大类：

3、第一类是传统有机小分子探针，其检测机制主要基于no与氧气反应生成氮氧化物，再通过邻苯二胺、hantzsch酯或芳香仲胺等识别基团发生亚硝化反应，从而产生荧光响应。这类探针的显著局限在于检测过程严重依赖氧气参与。由于实体瘤内部氧分压可低至0-20mmhg，在严重缺氧区域（o2<1mmhg），氧气不足导致目标分析物无法充分生成，使得该类探针的灵敏度和准确性显著下降。此外，目前已报道的有机小分子no探针大多发射波长位于可见光区（<650nm），组织穿透深度有限，难以满足深层组织成像的需求。

4、第二类是金属配合物类探针，其检测机制基于no与金属离子（如co(ii)、fe(ii)、ru(ii)、rh(ii)和cu(ii)等）之间的氧化还原反应。其中，cu(ii)配合物因其独特的响应机制受到广泛关注：顺磁性的cu(ii)能够有效淬灭配体的荧光，当no与cu(ii)配合物作用后，cu(ii)被还原为抗磁性的cu(i)，配合物解离，荧光得以恢复。这一检测机制不依赖no与氧气的预反应，对氧气的依赖性较低，更适用于缺氧微环境。lippard课题组早在2006年即报道了基于荧光素-铜配合物的no荧光探针，并成功用于活细胞内no的可视化成像。此后，研究者相继开发了多种铜配合物类no荧光探针，如基于半萘荧光素（seminaphthofluorescein）骨架的cu(ii)配合物探针，其在厌氧条件下与no反应可产生20-45倍的荧光增强；又如以罗丹明b为荧光标记的多胺铜配合物探针，对no的检测限低至1nm，并成功应用于细胞荧光成像；以及基于2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物的铜配合物探针，检测限达17nm。

5、然而，现有铜配合物类no荧光探针仍存在明显不足：大部分探针的发射波长仍处于可见光区（如半萘荧光素类探针发射波长为550-625nm、罗丹明b类探针发射波长亦在可见光区），组织穿透深度有限，在活体成像应用中受到制约。尽管已有研究者尝试开发近红外发射的铜基探针，但目前报道的此类探针多针对hno（no的单电子还原形式）而非no本身。因此，开发一种发射波长位于近红外区、能够在缺氧条件下高灵敏和高选择性地检测no且不依赖氧气参与的荧光探针，对于肿瘤缺氧微环境中no的精准检测及相关机制研究仍具有重要的科学意义和应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术中荧光探针在缺氧条件下检测一氧化氮时灵敏度低、依赖氧气参与反应以及缺乏近红外发射性能等问题，本发明提供了一种缺氧适用型一氧化氮近红外荧光探针及其制备方法和应用。

2、本发明通过分子设计，将二甲基半菁（半花菁）荧光团与二甲基吡啶胺（dpa）衍生物通过共轭连接，形成具有no响应功能的配体，再与cu(ii)配位构建了“关-开”型近红外荧光探针。该探针利用cu(ii)的顺磁性淬灭效应实现对荧光的有效关闭；当与no作用时，cu(ii)被还原为cu(i)，配合物解离，荧光团得以释放并恢复近红外荧光发射。由于该检测过程不涉及no与氧气的预反应，探针在缺氧条件下仍能保持优异的响应性能。

3、本发明所述缺氧适用型一氧化氮近红外荧光探针，其化学结构如下结构式ⅰ所示：

4、，其中，n为1~5的整数；x-为碘离子、溴离子或氯离子。

5、本发明还提供上述缺氧适用型一氧化氮近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

6、（1）结构式ii和结构式iii所示化合物在有机溶剂中，于碱作用下得到结构式iv所示中间体；

7、其中，所述结构式ii所示化合物具有如下结构：

8、；

9、所述结构式ⅲ所示化合物具有如下结构：

10、，n为1~5的整数；

11、所述结构式ⅳ所示中间体具有如下结构：

12、，n为1~5的整数；

13、（2）将步骤（1）得到的结构式iv所示中间体与铜盐进行络合反应，得到结构式i所示的一氧化氮近红外荧光探针。

14、步骤（1）中，所述结构式ii所示化合物与结构式iii所示化合物的摩尔比为1:0.5~2；所述碱选自三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、吡啶、碳酸钠、碳酸钾和碳酸铯中的至少一种；所述有机溶剂选自四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷、甲苯、三氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺中的至少一种；反应温度为室温至溶剂回流温度，反应时间为2~24小时。

15、步骤（2）中，所述结构式iv所示中间体与铜盐的摩尔比为1:0.5~3；所述铜盐选自氯化铜、溴化铜或碘化铜中的至少一种；络合反应在醇类、水或缓冲溶液中进行，室温搅拌反应5~60分钟即可完成。

16、本发明还提供了所述荧光探针在一氧化氮检测中的应用。

17、下面以实施例1制备的荧光探针a为例说明本发明荧光探针在荧光成像中的应用。

18、荧光探针a与一氧化氮作用后，一氧化氮可特异性的还原探针a结构中的二价铜离子为一价亚铜离子，从而点亮近红外荧光信号。

19、

20、取本发明实施例1制备的荧光探针a的缓冲溶液（5 μm），分别加入以下分析物：（1）空白对照；（2）h2o2（20 μm）；（3）no3-（20 μm）；（4）no2-（20 μm）；（5）onoo-（20 μm）；（6）•oh（20μm）；（7）o2-（20 μm）；（8）clo-（20 μm）；（9）hso3-（20 μm）；（10）一氧化氮（20 μm）。室温反应5分钟后，在激发波长690 nm处测定各溶液在760 nm处的荧光强度。若荧光探针a溶液荧光强度显著增强，则说明加入的是一氧化氮；若荧光探针a溶液荧光强度没有发生显著变化，则说明加入的是其他物质。结果如图4所示，仅一氧化氮可引起荧光探针a的荧光显著增强，表明该探针对一氧化氮具有良好的选择性。

21、以本发明实施例1制备的荧光探针a为例，以市售一氧化氮荧光探针daf-2（cas号：205391-02-2）为对照，通过无氧溶液中的no检测实验验证本发明在无氧环境中的适用性。将荧光探针a和daf-2的溶液（各5 μm）分别采用冻融-抽真空-解冻法进行脱氧处理：将各溶液密封于厚壁管中，浸入液氮冷冻，在仍浸没状态下抽真空5分钟；关闭旋塞后，将试管恢复至室温使溶剂完全解冻。该循环重复三次，最后一次循环结束后向试管中回充氮气。随后向各溶液中加入一氧化氮（20 μm），室温反应5分钟后，在激发波长690 nm处测定760 nm处的荧光强度。结果如图5所示，仅荧光探针a在no存在下荧光显著增强，表明本发明所述探针可实现无氧环境中一氧化氮的荧光检测。

22、取一系列等体积的浓度为5 μm的探针a的30%乙腈-pipes缓冲分散液，分别加入不同体积的no供体（dea·nonoate）储备液，使各体系中no的终浓度分别为0、4、5、7、9和10 μm。室温孵育5 min后，测定各溶液在激发波长690 nm、发射波长760 nm下的荧光信号（图6）。由图6可知，随着no浓度的增加，探针a在760 nm处的荧光信号强度逐渐增强。在no浓度为0~10 μm范围内，荧光强度与no浓度呈现良好的线性关系（r2= 0.99）。根据公式3σ/k计算，探针a对no的检测限约为89.3 nm，表明该探针可以实现高灵敏的no检测。

23、以本发明实施例1制备的荧光探针a为例，采用mtt法评估其细胞生物相容性。将raw264.7细胞接种于96孔板中，分别加入终浓度为0、1、2、5、10 μm的荧光探针a。细胞在37℃下培养24 h后，每孔加入mtt试剂，继续孵育4 h。随后小心吸去上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜（dmso），振荡10 min使甲瓒结晶充分溶解。于570 nm波长处用酶标仪测定各孔的吸光度（od）值。结果如图7所示，与对照组相比，各浓度处理组的细胞存活率均高于90%，表明该探针在实验浓度范围内细胞毒性较低，具有良好的生物相容性，可用于后续细胞成像分析。

24、以本发明实施例1制备的荧光探针a为例，通过炎症细胞成像实验验证其对细胞内源性一氧化氮的成像能力。将raw264.7细胞接种于细胞成像皿中，分为实验组和对照组。对照组正常培养24小时；实验组以脂多糖（lps）诱导24小时，刺激细胞产生大量内源性一氧化氮。随后，向两组细胞中分别加入荧光探针a（5 μm），pbs缓冲液洗涤后，用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光成像。结果如图8所示，对照组细胞中未见明显荧光信号，而实验组细胞呈现较强荧光。表明该探针可进入细胞并与内源性一氧化氮反应，产生强烈荧光信号，可实现细胞内一氧化氮的荧光成像分析。

25、以本发明实施例1制备的荧光探针a为例，通过缺氧肿瘤细胞成像实验，验证本发明在缺氧环境中对细胞内源性一氧化氮的成像能力。将人结直肠癌hct-116细胞接种于细胞成像皿中，分为对照组和实验组。对照组于常氧条件下正常培养24小时后加入pbs缓冲液；实验组于缺氧条件（1% o2）下培养24小时后，加入荧光探针a（5 μm）。采用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光成像，结果如图9所示。对照组细胞中未观察到明显荧光信号，而实验组细胞呈现较强荧光，表明探针a可有效进入细胞，并与缺氧微环境中产生的内源性一氧化氮发生响应，产生显著荧光信号，从而实现缺氧环境下细胞内一氧化氮的荧光成像分析。

26、所述荧光探针还可用于制备检测细胞、组织或活体中一氧化氮的试剂或试剂盒。该类试剂或试剂盒包含有效量的式i所示荧光探针以及可接受的载体或辅料，可用于肿瘤等缺氧微环境中一氧化氮的动态监测或荧光成像。

27、综上所述，本发明的有益效果包括但不限于：

28、1、本发明所提供的一氧化氮近红外荧光探针，可高灵敏、高选择性地与一氧化氮发生特异性响应，产生显著增强的近红外荧光信号；尤其重要的是，该探针的检测过程不依赖于氧气，在缺氧环境下仍能保持优异的检测性能，克服了传统有机小分子探针因氧气不足导致检测灵敏度下降的缺陷，适用于肿瘤等缺氧微环境中一氧化氮的动态监测。

29、2、本发明所提供的一氧化氮近红外荧光探针，可成功应用于细胞内外源性一氧化氮的荧光成像，并在缺氧肿瘤细胞中实现了内源性一氧化氮的可视化检测，为缺氧微环境中一氧化氮相关机制研究提供了有效的工具。

30、3、本发明所提供的一氧化氮近红外荧光探针的制备方法，原料易得、合成路线简洁、反应条件温和，可快速高效地制备目标探针，具有良好的可操作性和可重复性，适合规模化生产和推广应用。