小麦E3泛素连接酶基因PQT3及其在培育耐盐植物中的应用

本发明属于植物基因编辑，涉及小麦e3泛素连接酶基因pqt3及其在培育耐盐植物尤其是小麦中的应用。

背景技术：

1、土壤盐渍化是当前限制农业可持续发展和威胁粮食安全的重要非生物胁迫之一，过量盐分积累会破坏土壤结构与肥力，抑制作物生长并造成产量损失（tarolli et al.,2024）。fao最新评估表明，全球已有超过13.81亿公顷土地受到盐分影响，盐渍化范围仍在持续扩大（fao, 2024）。小麦是全球最重要的粮食作物之一，为人类提供约20%的热量，但是盐胁迫显著制约小麦生长和产量，限制其在盐碱地上的生产潜力。因此，挖掘小麦耐盐相关基因并解析其作用机制，对于培育耐盐小麦新品种、提高盐碱地利用效率和保障粮食安全具有重要意义（zhang et al., 2025）。

2、crispr/cas技术是一种高效的靶向基因编辑工具，可在向导rna引导下对目标dna位点进行特异识别和切割，并依赖细胞自身的dna修复过程在靶位点产生定向变异；该技术具有靶向性强、编辑效率较高，并可通过后代分离等策略获得无外源dna插入的突变材料等特点，在植物突变种质创制和作物遗传改良中展现出广阔的应用前景（uranga et al.,2024; cai et al., 2025）。

3、pqt3（paraquat tolerance 3）最早是在拟南芥中通过百草枯抗性筛选被鉴定出来一种e3泛素连接酶基因，与氧化胁迫响应密切相关。可被百草枯、过氧化氢、甘露醇、cdcl2和nacl等多种胁迫抑制表达，表明该基因参与了植物对氧化胁迫及相关非生物逆境的早期响应调控。

4、目前e3泛素连接酶在小麦耐盐过程中的功能和应用研究有限，小麦e3泛素连接酶基因pqt3在小麦耐盐中的功能和机制研究未见报道。

技术实现思路

1、本发明中，提供了一种小麦e3泛素连接酶基因pqt3，通过crispr/cas技术突变该基因后小麦耐盐能力提高，因此，本发明还要保护上述的小麦e3泛素连接酶基因pqt3在耐盐植物尤其是耐盐小麦中的应用。

2、本发明首先利用生物信息学分析确定pqt3在济麦22中的编码序列，然后在编码区设计两个同时靶向a、b、d三个部分同源基因的编辑靶点，构建小麦pqt3基因的编辑载体，最后通过农杆菌侵染小麦愈伤组织的方式获得pqt3基因功能敲除的pqt3小麦突变体，测序确定突变类型和纯合突变体，随后对突变体进行耐盐表型鉴定。

3、具体的，本发明提供的小麦e3泛素连接酶基因名称为pqt3，其核苷酸序列是包括下述（a1）或（a2）序列特征之一的序列：

4、（a1）序列表中的seq id no.1-3的序列中的任意一种或多种：

5、seq id no.1，是tapqt3a（基因id：traescs6a02g256800）的cdna序列；

6、seq id no.2，是tapqt3b（基因id：traescs6b02g268200）的cdna序列；

7、seq id no.3是tapqt3d（基因id：traescs6d02g238100）的cdna序列；

8、（a2）分别与seq id no.1，seq id no.2，seq id no.3核酸序列一致性在75%及以上的核苷酸序列。

9、上述小麦e3泛素连接酶基因pqt3的蛋白序列，其编码蛋白是具有下述(b1)和（b2）序列特征之一的蛋白质：

10、（b1）序列表中seq id no.4-6的序列中的任意一种或多种：

11、seq id no.4是tapqt3a蛋白序列；

12、seq id no.5是tapqt3b蛋白序列；

13、seq id no.6是tapqt3d蛋白序列；

14、（b2）将序列表中seq id no.4，seq id no.5，seq id no.6序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

15、本发明还提供了含上述小麦pqt3基因靶点序列的编辑载体pyl-crispr/cas9pubi-b-pqt3。

16、本发明所述基因pqt3在培育耐盐植物中的应用，该植物优选的是小麦。

17、任何一种可以将外源基因基因编辑靶点序列导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优选的基因编辑载体是pyl-crispr/cas9pubi-b-pqt3。

18、本发明所述的基因可用于培育耐盐小麦新品种。

19、本发明的有益效果：本发明首次克隆得到了小麦耐盐负调控基因pqt3，并利用crispr/cas9系统对其a、b、d三个亚基因组同源拷贝进行定点编辑，成功创制了三个同源拷贝同时突变的pqt3纯合突变体。经过比较分析证明，pqt3突变体的耐盐能力较野生型明显提高；pqt3突变体通过提高抗氧化酶活性减轻膜脂过氧化，增强细胞膜的稳定性，从而提高耐盐性。具体的分析及实验结论见实施例4中的内容。

1.小麦e3泛素连接酶基因pqt3，其特征在于，所述小麦e3泛素连接酶基因pqt3的核酸序列如（a1）所示：

2.如权利要求1所述的小麦e3泛素连接酶基因pqt3，其特征在于，所述小麦e3泛素连接酶基因pqt3的蛋白序列具有下述序列特征之一：

3.如权利要求1或2中任一项所述小麦e3泛素连接酶基因pqt3在培育耐盐植物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为小麦。

5.小麦e3泛素连接酶基因pqt3，其特征在于，所述小麦e3泛素连接酶基因pqt3的核酸序列如（a2）所示：

6.如权利要求5所述的小麦e3泛素连接酶基因pqt3，其特征在于，所述小麦e3泛素连接酶基因pqt3的蛋白序列具有下述序列特征之一：

7.如权利要求5或6中任一项所述小麦e3泛素连接酶基因pqt3在培育耐盐植物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为小麦。