一种蔗糖磷酸化酶突变体BaSP-P134A及在生产葡萄糖-1-磷酸中的应用的制作方法

本发明涉及生物工程，特别是涉及一种蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a及在生产葡萄糖-1-磷酸中的应用。

背景技术：

1、葡萄糖-1-磷酸（g-1-p）是一种由葡萄糖分子在1位发生磷酸化形成的单糖磷酸酯，是糖代谢途径中的关键中间体，水溶性良好。g-1-p在多种生物化学反应中发挥重要作用，尤其在糖原代谢、淀粉合成、糖苷衍生物制备等方面具有核心价值，是药物、食品发酵、酶催化合成等行业的重要功能性底物。例如，在细胞能量代谢与糖原补充过程中，g-1-p作为udp-葡萄糖合成的直接前体，可促进细胞糖代谢的高效运转。同时，g-1-p作为合成多糖、低聚糖的重要供体，可在生物制造领域中用于构建功能性寡糖或多糖材料。

2、天然来源的g-1-p含量极低，大量获取通常需要依靠人工制备。化学法是较早用于g-1-p制备的策略，但传统化学合成路线存在步骤复杂、收率偏低、副产物多、纯化困难等问题；相比之下，生物酶法可以实现g-1-p高选择性和高效率的制备，同时对于环境十分友好、分离纯化也更容易。因此，开发一种高效的生物酶法制备工艺，对g-1-p的工业化生产具有重要意义。近年来的研究表明，利用磷酸化相关酶（如蔗糖磷酸化酶）可以实现g-1-p的制备，且催化强度较高，对高底物浓度同样具有良好的适应性，并表现出较好的稳定性，因此蔗糖磷酸化酶酶法催化是极具工业化潜力的新一代g-1-p的制备方法。

3、然而，蔗糖磷酸化酶酶法制备g-1-p虽然具有选择性高、条件温和等优势，但在工业化应用中仍存在明显局限。首先，天然蔗糖磷酸化酶的催化效率偏低，使反应需要高酶量才能获得可观产率，从而提高了生产成本；同时该反应为可逆磷解过程，受到蔗糖与无机磷酸浓度的限制，反应平衡不利于g-1-p的充分累积，同时副产物果糖不仅产生产物抑制，还会增加后续分离纯化难度。此外，多数蔗糖磷酸化酶的稳定性不足，难以承受高温和高底物浓度条件，使其在高浓度蔗糖体系中易受抑制或失活；g-1-p本身对ph和温度亦较敏感，进一步压缩了工艺窗口，而固定化与连续化技术仍不够成熟，使蔗糖磷酸化酶法制备g-1-p的规模化生产仍面临较大挑战。因此，需要通过蛋白工程与分子修饰提高酶的催化效率与稳定性，以提升其工业应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a及在生产葡萄糖-1-磷酸中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的蔗糖磷酸化酶突变体可以高效制备g-1-p，并且生产强度较高，对高浓度底物催化效果好，酶表现出更好的稳定性，能够实现g-1-p的高效转化，进一步为蔗糖磷酸化酶突变体的工业应用提供了有利基础。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a，所述蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a的氨基酸序列如seq id no.3所示。

4、本发明提供了一种编码上述蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a的基因。

5、本发明提供了一种包含上述基因的重组载体。

6、本发明提供了一种包含上述基因的重组菌。

7、本发明提供了上述的蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a、上述的基因、上述的重组载体或上述的重组菌在制备葡萄糖-1-磷酸中的应用。

8、本发明提供了上述的蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a、上述的基因、上述的重组载体或上述的重组菌在提高葡萄糖-1-磷酸生产效率中的应用。

9、本发明提供了一种提高葡萄糖-1-磷酸生产效率的方法，包括利用上述的蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a催化蔗糖，合成葡萄糖-1-磷酸的步骤。

10、可选的是，所述合成葡萄糖-1-磷酸的过程中，以蔗糖为底物，以ph为8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃条件下反应，获得葡萄糖-1-磷酸。

11、本发明提供了上述的蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a、上述的基因、上述的重组载体或上述的重组菌在制备生产葡萄糖-1-磷酸的产品中的应用。

12、本发明提供了一种生产葡萄糖-1-磷酸的产品，所述产品包括上述的蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a、上述的基因、上述的重组载体或上述的重组菌。

13、本发明公开了以下技术效果：

14、本发明提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a，与野生型蔗糖磷酸化酶（basp）相比，蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a的最适催化条件没有发生改变，而突变体在37℃的vmax没变但km更低，与酶结合的亲和力以及催化效率显著提高。将该突变体应用于工业上生产g-1-p领域，可以高效制备g-1-p，并且生产强度较高，对高浓度底物催化效果好，酶表现出更好的稳定性，能够实现g-1-p的高效转化，进一步为蔗糖磷酸化酶突变体的工业应用提供了有利基础。

1.一种蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a的氨基酸序列如seq id no.3所示。

2.一种编码权利要求1所述蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a的基因。

3.一种包含权利要求2所述基因的重组载体。

4.一种包含权利要求2所述基因的重组菌。

5.权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌在制备葡萄糖-1-磷酸中的应用。

6.权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌在提高葡萄糖-1-磷酸生产效率中的应用。

7.一种提高葡萄糖-1-磷酸生产效率的方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a催化蔗糖，合成葡萄糖-1-磷酸的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述合成葡萄糖-1-磷酸的过程中，以蔗糖为底物，以ph为8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃条件下反应，获得葡萄糖-1-磷酸。

9.权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌在制备生产葡萄糖-1-磷酸的产品中的应用。

10.一种生产葡萄糖-1-磷酸的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体basp-p134a、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌。