一种L-组氨酸生产菌株及其构建方法与应用

本发明涉及生物技术与发酵工程，尤其是一种l-组氨酸生产菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

1、l-组氨酸（

l-histidine）是一种含有咪唑环的碱性氨基酸，在医药、食品、饲料及化妆品等领域具有广泛的应用价值。据统计，全球l-组氨酸市场需求呈稳步增长态势，对高效、低成本、可持续的生产技术提出了迫切需求。

2、目前，在代谢工程改造中所面临的主要问题包括：l-组氨酸会对关键酶

ncgl1504进行反馈抑制，使l-组氨酸不能高效地生成；atp和nadph的供应不足，也会限制l-组氨酸的产量。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种l-组氨酸生产菌株。

2、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述l-组氨酸生产菌株的构建方法。

3、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述l-组氨酸生产菌株的应用。

4、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

5、一种l-组氨酸生产菌株，命名为his-13，是以野生型谷氨酸棒状杆菌

corynebacterium glutamicum作为出发菌株利用代谢工程手段进行基因编辑获得的：过表达

ncgl1505基因

、ncgl2093基因

、ncgl2096基因

、ncgl2094基因

、ncgl2097基因

、ncgl2100基因

、ncgl0218基因

、ncgl2101基因

、ncgl0799基因和

ncgl2102基因，过表达突变后的

ncgl1504

y56m，t235p基因；异源引入大肠杆菌

escherichia coli来源的

pntab基因；过表达外排蛋白

ncgl1262基因；敲除

ncgl0909基因、

ncgl2632基因和

ncgl0580基因；过表达

ncgl1610-1609-1608操纵子。

6、优选的，上述l-组氨酸生产菌株，在野生型谷氨酸棒状杆菌

corynebacterium

glutamicum基因组上用p

tuf启动子驱动

ncgl1505基因

、ncgl2093基因

、ncgl2096基因

、

ncgl2094基因

、ncgl2097基因

、ncgl2100基因

、ncgl0218基因

、ncgl2101基因

、ncgl0799基因和

ncgl2102基因过表达，用p

tuf启动子驱动突变后的

ncgl1504

y56m，t235p基因过表达；异源引入大肠杆菌来源的

pntab基因并用p

tuf启动子驱动过表达；用p

sod启动子驱动外排蛋白

ncgl1262基因过表达；敲除

ncgl0909基因、

ncgl2632基因和

ncgl0580基因；用p

tuf启动子驱动

ncgl1610-1609-1608操纵子过表达。

7、优选的，上述l-组氨酸生产菌株，所述

ncgl2102基因、

ncgl2101基因和

ncgl2100基因以

ncgl2102-2101-2100天然操纵子的形式过表达；

ncgl2097基因和

ncgl2096基因以

ncgl2097-2096天然操纵子的形式过表达；

ncgl2094基因和

ncgl2093基因以

ncgl2094-2093天然操纵子的形式过表达。

8、优选的，上述l-组氨酸生产菌株，所述野生型谷氨酸棒状杆菌

corynebacterium

glutamicum为野生型谷氨酸棒状杆菌

corynebacterium glutamicumatcc 13032。

9、优选的，上述l-组氨酸生产菌株，所述

ncgl0909基因的核苷酸序列如序列表seqid no.1所示；

ncgl2632基因的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；

ncgl0580基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示。

10、优选的，上述l-组氨酸生产菌株，所述

ncgl1610-1609-1608操纵子的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示；

ncgl1610基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示；

ncgl1609基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示；

ncgl1608基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示。

11、优选的，上述l-组氨酸生产菌株，所述

ncgl2102-2101-2100天然操纵子的核苷酸序列如序列表seq id no.8；

ncgl2102基因的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示；

ncgl2101基因的核苷酸序列如序列表seq id no.10所示；

ncgl2100基因的核苷酸序列如序列表seq id no.11所示；

ncgl2097-2096天然操纵子的核苷酸序列如序列表seq id no.12所示；

ncgl2097基因的核苷酸序列如序列表seq id no.13所示；

ncgl2096基因的核苷酸序列如序列表seq id no.14所示；

ncgl2094-2093天然操纵子的核苷酸序列如序列表seq idno.15所示；

ncgl2094基因的核苷酸序列如序列表seq id no.16所示；

ncgl2093基因的核苷酸序列如序列表seq id no.17所示；

ncgl0218基因的核苷酸序列如序列表seq id no.18所示;

ncgl0799基因的核苷酸序列如序列表seq id no.19所示;

ncgl1505基因的核苷酸序列如序列表seq id no.20所示；

ncgl1504

y56m，t235p基因的核苷酸序列如序列表seq id no.21所示; 大肠杆菌

escherichia coli来源的

pntab基因的核苷酸序列如序列表seq id no.22所示；大肠杆菌

escherichia coli来源的

pnta基因的核苷酸序列如序列表seq id no.23所示；大肠杆菌

escherichia coli来源的

pntb基因的核苷酸序列如序列表seq id no.24所示；外排蛋白

ncgl1262基因的核苷酸序列如序列表seq id no.25所示。

12、优选的，上述l-组氨酸生产菌株，所述p

tuf启动子的核苷酸序列如序列表seq idno.37所示，p

sod启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.26所示。

13、上述l-组氨酸生产菌株的构建方法，在出发菌株野生型谷氨酸棒状杆菌

corynebacterium glutamicum基础上进行定向改造，具体步骤如下：

14、（1）基因组上过表达

ncgl1505基因

、ncgl2093基因

、ncgl2096基因

、ncgl2094基因

、

ncgl2097基因

、ncgl2100基因

、ncgl0218基因

、ncgl2101基因

、ncgl0799基因

、ncgl2102基因，以及过表达内源突变后的

ncgl1504

y56m，t235p基因；

15、（2）异源引入大肠杆菌来源的

pntab基因；

16、（3）过表达外排蛋白

ncgl1262基因；

17、（4）敲除

ncgl0909基因、

ncgl2632基因和

ncgl0580基因，并过表达

ncgl1610-1609-

1608操纵子。

18、优选的，上述l-组氨酸生产菌株的构建方法，具体步骤如下：

19、1）在

ncgl3068位点使用p

tuf启动子驱动n

cgl2102-2101-2100操纵子过表达；

20、2）在

ncgl1781位点使用p

tuf启动子驱动

ncgl2097-2096操纵子过表达；

21、3）在

ncgl1775位点使用p

tuf启动子驱动

ncgl2094-2093操纵子过表达；

22、4）在

ncgl1790位点使用p

tuf启动子驱动

ncgl0218基因过表达；

23、5）在

ncgl1774位点使用p

tuf启动子驱动

ncgl0799基因过表达；

24、6）在

ncgl1773位点使用p

tuf启动子驱动

ncgl1505基因过表达；

25、7）在

ncgl1817位点使用p

tuf启动子驱动

ncgl1504

y56m，t235p基因过表达；

26、8）在

ncgl2998位点使用p

tuf启动子驱动大肠杆菌来源的

pntab过表达；

27、9）在

ncgl2949位点使用p

sod启动子驱动

ncgl1262基因过表达；

28、10）敲除

ncgl0909基因；

29、11）敲除

ncgl2632基因；

30、12）敲除

ncgl0580基因；

31、13）在

ncgl2923位点使用p

tuf启动子驱动

ncgl1610-1609-1608操纵子过表达。

32、上述

ncgl3068的核苷酸序列如序列表seq id no.27所示；

ncgl1781的核苷酸序列如序列表seq id no.28所示；

ncgl1775的核苷酸序列如序列表seq id no.29所示；

ncgl1790的核苷酸序列如序列表seq id no.30所示；

ncgl1773的核苷酸序列如序列表seqid no.31所示；

ncgl1774的核苷酸序列如序列表seq id no.32所示；

ncgl1817的核苷酸序列如序列表seq id no.33所示；

ncgl2998的核苷酸序列如序列表seq id no.34所示；

ncgl2949的核苷酸序列如序列表seq id no.35所示；

ncgl2923的核苷酸序列如序列表seqid no.36所示。

33、上述l-组氨酸生产菌株在生产l-组氨酸中的应用。

34、优选的，上述应用，采用发酵方法生产l-组氨酸。

35、优选的，上述应用，使用发酵罐进行发酵：按20％接种量接种种子液到发酵培养基中，发酵过程中通过流加氨水维持ph在7.0。

36、优选的，上述应用，具体步骤如下：

37、（1）斜面种子培养：将菌株从-80℃的20%甘油保菌管接入固体斜面活化培养，培养条件为32℃、12h，共活化两代，使用第二代固体斜面上的菌作为种子罐的出发菌；

38、（2）发酵罐种子培养：使用无菌的生理盐水洗下二代固体斜面菌体，全部接入5 l发酵罐内培养，培养基定容至2 l，培养条件为32℃，ph 7.0，溶氧30-50%，培养至od600nm达到15；

39、（3）发酵罐发酵培养：按20％接种量接种种子液到发酵培养基中，培养基定容2l，培养条件为32℃，溶氧30-50%，发酵过程中通过流加氨水维持ph在7.0左右。

40、优选的，上述应用，使用的斜面培养基为：bhi培养基。

41、优选的，上述应用，使用的种子培养基为：mgso4·7h2o 1g/l，酵母粉4g/l，蛋白胨2g/l，k2hpo4·3h2o 4g/l，谷氨酸1.3g/l，feso4·7h2o 8mg/l，mnso46mg/l，vb1、vb3、vb5各2mg/l，硫酸铵8g/l。

42、优选的，上述应用，使用的发酵培养基为：mgso4·7h2o 2g/l，酵母粉4g/l，蛋白胨3g/l，k2hpo4·3h2o 6g/l，谷氨酸1.3g/l，feso4·7h2o 30mg/l，mnso410mg/l，vb1、vb3、vb5各2mg/l，硫酸铵8g/l。

43、上述培养基均可采用标准方法制备获得。

44、有益效果：

45、上述l-组氨酸生产菌株，构建过程采用atp优化策略，包括敲除

ncgl0909基因、

ncgl2632基因

、ncgl0580基因，从能量代谢的角度上，敲除非必需atp消耗基因，减少atp的损失，使更多的atp有效用于产物的合成；尤其

ncgl0580敲除后，糖酵解途径中多个关键基因的转录水平显著上调，有利于atp的生成；过表达突变后的

ncgl1504

y56m，t235p基因，通过改变酶的调控结构域，产物l-组氨酸不能与其结合使其蛋白构象发生改变，从而提升组氨酸的产量；过表达

ncgl1610-1609-1608操纵子，使氧化磷酸化水平提高，促进atp的生成；采用特定的启动子过表达特定基因，结合atp优化策略，使得到的菌株合成效率和生产强度显著提升。