一种快速检测基孔肯雅病毒的微流控芯片及其试剂盒和应用

本发明涉及病毒检测，特别涉及一种快速检测基孔肯雅病毒的微流控芯片及其试剂盒和应用。

背景技术：

1、本领域常规方案检测基孔肯雅病毒的方法为实时荧光定量聚合酶链式反应（实时荧光定量pcr）。该技术依托核酸扩增原理，在pcr反应体系中引入荧光基团；核酸扩增过程中产生荧光信号，检测设备实时采集荧光强度，荧光信号强弱与扩增产物总量正相关。结合荧光信号变化曲线与标准曲线，可实现靶标核酸的定性判别与精确定量。但该方法扩增反应需要精密控温设备，存在检测周期长、试剂成本偏高的问题，同时对实验场地环境、操作人员专业水平均有较高要求，难以适配基层现场、即时快速检测的应用场景。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明旨在解决现有检测技术依赖精密仪器、专业技术人员的痛点，缩短检测时长、降低检测成本，实现基孔肯雅病毒早期现场快速诊断与疫情防控。为此，本发明提出一种快速检测基孔肯雅病毒的微流控芯片及其试剂盒和应用。

2、本发明提供一种快速检测基孔肯雅病毒的微流控芯片，所述芯片自上而下依次为顶层盖板、第一通道层、rt-rpa（重组酶聚合酶等温扩增）反应层、隔离层、crispr(规律成簇间隔短回文重复序列)反应层、第二通道层、试纸条夹层、底层盖板，各层板叠合密封；所述rt-rpa反应层包括rt-rpa扩增腔；所述crispr反应层内置crispr识别腔及crispr试剂储存腔；所述隔离层设于rt-rpa扩增腔与crispr识别腔之间；所述隔离层分隔rt-rpa扩增腔与crispr识别腔；所述试纸条夹层预装侧向层析试纸条。

3、顶层盖板作为芯片最外层物理屏障，防止液体蒸发与外部污染，同时提供加样孔与气压平衡孔的结构支撑；底层盖板可封闭芯片底部，支撑试纸条夹层，防止液体渗漏，维持芯片整体结构强度与气密性；试纸条夹层固定侧向层析试纸条，提供层析反应空间，使标记探针与捕获配体在试纸条上完成免疫层析显色；第一通道层设置废液通道与rt-rpa扩增腔的进液流道，引导样本与rt-rpa反应试剂定量分配，引导rt-rpa产物进入crispr识别腔；第二通道层设置连通crispr识别腔与试纸条夹层的流道，引导crispr反应液向层析方向流动；rt-rpa反应层内置rt-rpa扩增腔，为恒温逆转录与核酸扩增提供密闭反应空间；crispr反应层内置crispr识别腔，预封装crispr反应试剂，为cas蛋白切割反应提供恒温反应空间；隔离层可物理隔断rt-rpa扩增腔与crispr识别腔，防止核酸气溶胶交叉污染；隔离层上开设有液体转移通孔，所述通孔通过液体表面张力与通孔几何尺寸产生的毛细阻滞作用，在常态下将反应液约束于rt-rpa扩增腔内以阻断核酸气溶胶污染；所述通孔在受到沿其轴向的离心力作用时导通，使扩增产物由rt-rpa扩增腔单向流入crispr识别腔。

4、所述微流控芯片自上而下分层设置独立rt-rpa扩增腔、crispr识别腔，两腔之间设置隔离层，芯片末端预装侧向层析试纸条；依靠多层板材压合实现全密闭反应空间，由于液体表面张力及所述通孔几何尺寸产生的毛细阻滞作用，rt-rpa扩增腔内的反应液被约束于rt-rpa扩增腔内，不会自发通过通孔流入crispr识别腔。rt-rpa扩增完成后，对芯片施加沿通孔轴向（由rt-rpa扩增腔指向crispr识别腔方向）的瞬时离心力。在离心力作用下，液体所受驱动力突破表面张力形成的毛细屏障，液体通过通孔由rt-rpa扩增腔单向流入crispr识别腔，与预封装的crispr反应试剂混合发生切割反应。隔离层分隔两步反应腔体、阻断核酸气溶胶交叉污染，仅在需要转移产物时通过手甩离心使产物经液体转移通道孔洞进入crispr识别腔，整套扩增、识别、显色流程集成在芯片内部密闭完成，解决传统分步开盖操作易污染、需多设备配合的缺陷。

5、进一步的，所述微流控芯片的各层板材选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯中的任意一种，在一些具体的实施例中，所述微流控芯片的各层的板材都采用聚甲基丙烯酸甲酯。

6、本发明提供一种快速检测基孔肯雅病毒的检测试剂盒，包括所述的微流控芯片、rt-rpa反应试剂和crispr反应试剂，所述crispr反应试剂预先封装于crispr识别腔中，所述rt-rpa反应试剂独立设置。

7、进一步的，所述rt-rpa反应试剂包括逆转录酶、引物、rpa扩增酶、乙酸镁、水及缓冲液，所述引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。

8、进一步的，所述crispr反应试剂包括crrna、cas蛋白、单链dna报告分子、水及缓冲液，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.3所示。

9、进一步的，所述单链dna报告分子为核苷酸两端双标记的结构，其中，一端为荧光标记基团，包括6-羧基荧光素、cy3、cy5、中的任意一种；另一端为亲和捕获标记基团，包括生物素、地高辛中的任意一种。

10、所述单链dna序列为不与chikv互补的通用非特异性序列，所述单链dna报告分子包括荧光标记基团与亲和捕获标记基团，可同时在层析试纸形成检测线与质控线，探针被活化cas蛋白切断后两种标记基团分离，仅保留质控线条带实现阳性判定。

11、在一些实施方式中，所述核苷酸的序列为ttatt。

12、进一步的，所述cas蛋白包括cas12a、cas12b、cas12f中的任意一种。所述cas蛋白，均拥有靶标核酸识别后激活非特异性单链dna旁切酶活性的共性，均可切割本发明的ssdna报告分子输出检测信号。

13、进一步的，所述试剂盒适用于包括人血清、蚊虫媒介、环境和动物样本中任意一种的检测。本体系靶向病毒高度保守e基因，灵敏度可达1fg/μl质粒，不受样本基质干扰，对近缘虫媒病毒无交叉阳性信号，能够满足临床诊断、媒介监测、环境筛查多场景使用需求。

14、本发明提供一种快速检测基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，使用所述的检测试剂盒，包括如下步骤：将待测样本与rt-rpa反应试剂混合，加入rt-rpa扩增腔，37-42℃孵育25-60 min进行核酸扩增，再通过离心，使扩增产物经液体转移通道孔洞进入crispr识别腔发生反应，最后通过试纸条夹层读取检测信号。

15、在一些具体实施方式中，离心的方式为手甩离心。

16、本发明还提供一种所述检测试剂盒在检测基孔肯雅病毒中的应用。

17、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

18、（1）本发明技术方案使用rt-rpa/crispr及微流控芯片结合方案，可提升现场早期检测的简便性、缩短检测时长，无需大型精密仪器，降低检测成本与操作门槛，便于基层大规模筛查工作。

19、（2）本发明构建的rt-rpa-crispr/cas12a检测体系灵敏度与特异性强，能够实现低病毒载量早期样本筛查；体系仅靶向基孔肯雅病毒e基因保守区，不会与寨卡、黄热、乙脑、登革等同类虫媒病毒发生交叉反应，且临床诊断精准可靠。

20、（3）本发明采用双标记ssdna探针结合芯片内置侧向层析试纸条，无需专业荧光仪器即可肉眼直观判读阴阳性，还能通过图像灰度值完成信号半定量分析；微流控芯片腔室可预先封装crispr反应试剂，试剂消耗量少、整体检测成本更低，且整套检测方案兼容人体血清、蚊虫媒介、环境病毒等多种待测样本，适用检测场景更加广泛。