一种食用菌活性提取物的制备方法及其食品应用与流程

本发明涉及食品科学与工程及天然产物化学工程，具体涉及一种食用菌活性提取物的制备方法及其食品应用。

背景技术：

1、食用菌（edible fungi）是一类具有重要营养价值的大型真菌，其富含多糖、萜类化合物、甾醇及多肽等活性成分，在食品配料及功能因子开发领域具有重要价值。其中，猴头菇（hericium erinaceus）、平菇（pleurotus ostreatus）和银耳（tremella fuciformis）作为我国广泛栽培的代表性食用菌，其活性成分的提取与利用一直是食品科学及天然产物化学领域的研究热点。

2、猴头菇多糖主要为β-葡聚糖，具有高分子量及良好的水溶性与黏度特性；平菇中的洛伐他汀（lovastatin）为脂溶性内酯类小分子化合物，对热及酸碱环境较为敏感；银耳多糖则属于酸性杂多糖，分子量分布广且常与蛋白质、色素等杂质紧密结合。上述三种活性成分在化学性质上存在显著差异：猴头菇多糖和银耳多糖为水溶性大分子，而洛伐他汀为脂溶性小分子，这给在同一工艺体系中实现多种活性成分的共提取与定向分离带来了巨大挑战。

3、目前，食用菌活性成分的提取主要采用热水浸提法、酶解法、超声波辅助提取法及微波辅助提取法等。热水浸提法操作简单、成本低廉，但存在提取温度高、耗时长、热敏性成分易降解等缺陷。酶解法利用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等酶制剂降解食用菌细胞壁，可有效提高活性成分的溶出率，但单一酶解条件难以兼顾不同菌种细胞壁组成的差异。超声波辅助提取法通过空化效应破坏细胞壁结构，具有提取时间短、效率高的优点，但单独使用超声波难以实现复杂基质中多种活性成分的选择性释放。近年来，酶解与超声波联合提取技术得到了广泛研究，但仍主要针对单一菌种的单一目标产物，尚未见针对混合原料中多种菌种、多种活性成分的差异化提取方案。

4、在分离纯化方面，食用菌多糖的纯化通常采用膜过滤、大孔吸附树脂、柱层析及乙醇分级沉淀等方法。膜过滤技术依据分子量差异实现组分的分级分离，在单一多糖的纯化中已有较多应用。然而，当面对混合原料来源的复杂多糖体系时，不同菌种来源的多糖分子量分布范围存在显著重叠，仅靠膜过滤难以实现精准分离。乙醇分级沉淀虽可根据多糖的溶解度差异进行初步分级，但单独使用时往往纯度不足，且沉淀过程中易造成活性成分的损失。大孔吸附树脂及柱层析技术多用于单一目标产物的纯化，在混合多糖体系中易因竞争吸附导致分离效率下降。

5、在食用菌复合多糖的制备方面，已有将多种食用菌原料混合后提取复合多糖的技术报道。例如，将香菇、银耳、猴头菇粉末按一定比例混合后，经脱脂、超声水提、过滤、浓缩、洗涤、干燥制得复合多糖。然而，这类方法均采用同一提取条件对混合原料进行处理，未考虑不同食用菌细胞壁化学组成的差异，亦未针对不同菌种来源的活性成分设计差异化的释放条件。由于猴头菇细胞壁以几丁质-纤维素复合基质为主、平菇细胞壁以纤维素-半纤维素为主、银耳子实体则以多糖胶质结构为特征，三种细胞壁结构对酶解条件的响应截然不同，采用同一条件提取必然导致部分菌种的活性成分释放不充分或过度降解。此外，现有技术中尚未见在同一工艺流中，针对混合原料中不同菌种的细胞壁基质差异设计序贯酶解条件，并同步实现脂溶性成分与水溶性多糖定向分离的报道。

6、在多糖化学修饰方面，银耳多糖的硫酸酯化修饰已有文献报道。已有研究采用氯磺酸-吡啶法对纯化后的单一银耳多糖进行硫酸酯化，以改善其水溶性及流变学特性。但这些研究均以纯化后的单一银耳多糖为原料进行化学修饰，并未涉及在混合多糖体系中实现银耳多糖的选择性硫酸酯化，也未与猴头菇多糖、平菇洛伐他汀的提取过程形成集成化工艺。

7、综上所述，现有技术中缺乏一种能够在同一连续工艺流中，针对包含两种及以上细胞壁基质类型存在差异的多种食用菌混合原料，利用其细胞壁基质差异及活性成分理化特性差异，实现分区序贯酶解、定向分离及功能化修饰的集成化制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种食用菌活性提取物的制备方法，将多种食用菌子实体的混合原料置于同一连续工艺流中，通过分区序贯酶解与连续化分离，定向获得与原料相应的活性组分，解决现有技术中混合原料统一处理导致的活性成分释放不充分、过度降解及多组分分离精度不足的问题。

2、本发明所述“多种食用菌”指包含两种及以上细胞壁基质类型存在差异的食用菌子实体的组合，例如具有几丁质-纤维素复合壁的菌类（如猴头菇）、具有纤维素-半纤维素壁的菌类（如平菇）及具有多糖胶质壁的菌类（如银耳）。由于本发明核心在于利用不同菌种细胞壁基质的差异性，通过ph梯度与酶系匹配进行定向序贯降解，因此该工艺可扩展应用于其他具有类似细胞壁结构差异的食用菌组合。

3、本发明的另一目的在于提供一种上述食用菌活性提取物的制备方法制备得到的食用菌活性提取物作为食品配料的应用，利用各活性组分的天然理化性质差异，在食品体系中协同构成稳定的多相分散体系。

4、本发明所述食用菌活性提取物的制备方法，将多种食用菌子实体的混合原料置于同一连续工艺流中，经分区序贯酶解与连续化分离定向获得与原料相应的活性组分，包括以下步骤：

5、s1.将多种食用菌子实体混合，经低温清洗、冷冻干燥、超微粉碎及脱脂，得预处理混合原料；

6、s2.将预处理混合原料依次通过第一、第二、第三酶解单元进行分区序贯酶解，单元间连续输送并与酶解过程同步施加脉冲式超声波，利用各单元间ph梯度与酶系差异对混合原料中不同菌种的细胞壁基质进行定向序贯降解；

7、s3.将步骤s2经分区序贯酶解后的酶解液过滤之后，以有机溶剂萃取分离得有机相和水相；有机相经浓缩、柱层析及低温结晶得脂溶性活性晶体；水相经乙醇分级沉淀辅助及多级膜过滤依分子量差异分离得高分子量多糖馏分和中分子量多糖馏分；高分子量多糖馏分经定向硫酸酯化修饰得硫酸酯化多糖，中分子量多糖馏分经浓缩干燥得多糖提取物；

8、s4.将步骤s3所得各活性组分按产品需求复配，得食用菌活性提取物。

9、优选地，所述多种食用菌子实体包括猴头菇、平菇和银耳。

10、进一步地，步骤s2中所述分区序贯酶解的具体操作为：第一酶解单元控制碱性条件进行碱提水解，选择性松动银耳多糖表面的蛋白包裹结构；第二酶解单元调节至弱酸性条件，加入由纤维素酶、果胶酶与中性蛋白酶组成的复合酶系，定向降解猴头菇细胞壁中胶层及银耳残留蛋白连接结构；第三酶解单元调节至近中性条件，加入由纤维素酶、半纤维素酶与碱性蛋白酶组成的复合酶系，温和释放平菇中的热敏性洛伐他汀与水溶性多糖。

11、更进一步地，所述第一酶解单元的ph为8.5–10.5、温度为60–80℃、时间为0.5–1.5h；所述第二酶解单元的ph为4.5–6.0、温度为45–55℃、时间为1.5–3h；所述第三酶解单元的ph为6.0–7.5、温度为40–50℃、时间为2–4h。

12、优选地，步骤s2中所述脉冲式超声波的频率为20–40khz，功率密度为100–350w/l，脉冲模式为开2–5s/关1–2s。

13、优选地，步骤s3中所述有机溶剂为乙酸乙酯或体积分数75–95%的乙醇，萃取温度为30–50℃，萃取次数为2–3次；所述低温结晶温度为4–10℃，结晶时间为12–48h。

14、优选地，步骤s3中所述乙醇分级沉淀辅助为：控制乙醇体积分数为35–55%，使高分子量多糖选择性沉淀，上清液经所述多级膜过滤分离得中分子量多糖馏分，沉淀复溶后依次经所述多级膜过滤脱盐精制得高分子量多糖馏分；所述多级膜过滤为三级串联膜过滤系统，依次为孔径0.1–0.45μm的微滤膜、截留分子量10–50kda的超滤膜和截留分子量200–500da的纳滤膜；所述定向硫酸酯化修饰采用氯磺酸-吡啶法，反应温度60–80℃，反应时间2–4h。

15、优选地，步骤s1中所述猴头菇、平菇、银耳的混合质量比为(3–5):(2–4):(1–3)；步骤s4中所述复配的质量比为猴头菇多糖提取物:洛伐他汀晶体:硫酸酯化银耳多糖=(5–15):(0.5–2):(3–8)。

16、优选地，步骤s1中所述冷冻干燥的条件为-45℃至-55℃、真空度≤5pa；所述脱脂为超临界co2脱脂，萃取压力25–35mpa，萃取温度35–45℃。

17、优选地，步骤s2中各酶解单元为独立反应器，单元间通过密闭管道连接，管道内设置在线清洗喷头，以纯化水或ph过渡缓冲液对管道进行冲洗；且各单元反应结束后先进行固液分离，固体物料经洗涤后再进入下一酶解单元，避免前一单元的液体酶系及酸性/碱性环境对下一单元酶活性的抑制。

18、本发明还提供一种根据上述食用菌活性提取物的制备方法制备得到的食用菌活性提取物作为食品配料的应用，所述多糖提取物与硫酸酯化多糖协同构成水相增稠体系，所述脂溶性活性晶体分散于该水相增稠体系中，所述食用菌活性提取物在食品中的添加量为0.5–10wt%，且所述脂溶性活性晶体在所述水相增稠体系中的质量中值粒径d50为1–20μm，所述d50系将所述食用菌活性提取物按5wt%添加量分散于水相食品基质中测得。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、1、本发明首次将多种食用菌子实体的混合原料纳入同一连续工艺流，通过分区序贯酶解策略，针对不同菌种的细胞壁基质差异（猴头菇几丁质-纤维素复合壁、平菇纤维素-半纤维素壁、银耳多糖胶质壁）分别设置适配的ph梯度与酶系，克服了现有技术中混合原料统一处理导致的部分菌种活性成分释放不充分或过度降解的问题，实现了三种活性组分的高效同步溶出；

21、2、本发明在分离阶段采用乙醇分级沉淀辅助多级膜过滤的连续化分离序列，利用乙醇体积分数调控实现高分子量多糖的选择性预沉淀，有效解决了不同菌种来源多糖分子量分布重叠导致的膜分离边界不清问题，显著提高了各多糖馏分的分离纯度；

22、3、本发明通过液液萃取、柱层析及低温结晶的连续化操作，在同一工艺流中同步获得脂溶性的活性晶体与水溶性的多糖提取物，避免了传统工艺中分别提取、分别纯化造成的流程冗长及能耗高的问题，提高了工艺集成度与物料利用率；

23、4、本发明在酶解单元间设置独立反应器、在线清洗及固液分离再进料机制，有效避免了不同ph环境及酶系在管道中的交叉污染与失活问题，保障了分区序贯酶解的工艺稳定性，适用于工业化连续生产；

24、5、本发明制备得到的食用菌活性提取物作为食品配料应用时，利用多糖提取物的界面活性、硫酸酯化多糖的聚阴离子增稠特性以及脂溶性活性晶体的脂溶性，在食品体系中协同构成稳定的水相增稠体系及脂相分散体系，无需额外添加合成乳化剂及合成增稠剂即可实现脂溶性成分在水相食品基质中的均匀分散，符合清洁标签食品配料的发展趋势。