一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体及其应用

本发明涉及一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程。

背景技术：

1、自然界中，所有生命体均依赖由数千种氧化还原酶催化的氧化还原反应，而这些氧化还原酶仅利用少数几种辅酶就能完成整个催化反应。其中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+/nadh)及其磷酸化形式(nadp+/nadph)作为关键辅酶，被三分之二的氧化还原酶用于氢负离子的传递与储存，这些氢负离子最终参与合成多种高附加值生物分子。

2、天然辅酶(nad(p)+)依赖型氧化还原酶被广泛的应用于可替代传统有机合成的生物催化反应中。然而，天然辅酶昂贵的价格和不稳定性，限制了类似氧化还原反应的规模化应用。使用高稳定、低成本的仿生辅酶替代不稳定、昂贵的天然辅酶是降低辅酶使用成本的有效方法。但是，仿生辅酶稳定性的提高、氧化还原酶利用仿生辅酶的催化能力的提高以及还原态仿生辅酶的再生，仍是目前亟待解决的问题。

3、在产氢和产电等体外多酶催化体系中，辅酶是介导电子和质子传递进而生成产物的关键。因此，针对产氢和产电等体外多酶体系开发更多稳定性更高的仿生辅酶，以及对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase,g6pdh,ec 1.1.1.49)进行相应仿生辅酶偏好性改造，具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种仿生辅酶cnmn偏好性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase,g6pdh,ec 1.1.1.49)相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸、第117位丝氨酸突变为了赖氨酸、第417位酪氨酸突变为了组氨酸、第118位脯氨酸突变为了丙氨酸、第46位精氨酸突变为了天冬酰胺、第415位异亮氨酸突变为了蛋氨酸、第330位异亮氨酸突变为了苏氨酸、第129位赖氨酸突变为了谷氨酸、第220位异亮氨酸突变为了缬氨酸、第354位异亮氨酸突变为了缬氨酸、第277位异亮氨酸突变为了缬氨酸、第443位异亮氨酸突变为了缬氨酸和/或第456位丝氨酸突变为了精氨酸。

2、在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸，将其命名为m-1；

3、或者，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸，且第117位丝氨酸突变为了赖氨酸，将其命名为m-2；

4、或者，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸，第117位丝氨酸突变为了赖氨酸，且第417位酪氨酸突变为了组氨酸，将其命名为m-3；

5、或者，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸，第117位丝氨酸突变为了赖氨酸，第417位酪氨酸突变为了组氨酸，且第118位脯氨酸突变为了丙氨酸，将其命名为m-4；

6、或者，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸，第117位丝氨酸突变为了赖氨酸，第417位酪氨酸突变为了组氨酸，第118位脯氨酸突变为了丙氨酸，第46位精氨酸突变为了天冬酰胺，且第415位异亮氨酸突变为了蛋氨酸，将其命名为m-5；

7、或者，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸，第117位丝氨酸突变为了赖氨酸，第417位酪氨酸突变为了组氨酸，第118位脯氨酸突变为了丙氨酸，第46位精氨酸突变为了天冬酰胺，第415位异亮氨酸突变为了蛋氨酸，且第330位异亮氨酸突变为了苏氨酸，将其命名为m-6；

8、或者，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸，第117位丝氨酸突变为了赖氨酸，第417位酪氨酸突变为了组氨酸，第118位脯氨酸突变为了丙氨酸，第46位精氨酸突变为了天冬酰胺，第415位异亮氨酸突变为了蛋氨酸，且第330位异亮氨酸突变为了苏氨酸，第129位赖氨酸突变为了谷氨酸，且第220位异亮氨酸突变为了缬氨酸，将其命名为m-7；

9、或者，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸，第117位丝氨酸突变为了赖氨酸，第417位酪氨酸突变为了组氨酸，第118位脯氨酸突变为了丙氨酸，第46位精氨酸突变为了天冬酰胺，第415位异亮氨酸突变为了蛋氨酸，第330位异亮氨酸突变为了苏氨酸，且第129位赖氨酸突变为了谷氨酸，第220位异亮氨酸突变为了缬氨酸，且第354位异亮氨酸突变为了缬氨酸，将其命名为m-8；

10、或者，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸，第117位丝氨酸突变为了赖氨酸，第417位酪氨酸突变为了组氨酸，第118位脯氨酸突变为了丙氨酸，第46位精氨酸突变为了天冬酰胺，第415位异亮氨酸突变为了蛋氨酸，第330位异亮氨酸突变为了苏氨酸，且第129位赖氨酸突变为了谷氨酸，第220位异亮氨酸突变为了缬氨酸，第354位异亮氨酸突变为了缬氨酸，且第277位异亮氨酸突变为了缬氨酸，将其命名为m-9；

11、或者，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸，第117位丝氨酸突变为了赖氨酸，第417位酪氨酸突变为了组氨酸，第118位脯氨酸突变为了丙氨酸，第46位精氨酸突变为了天冬酰胺，第415位异亮氨酸突变为了蛋氨酸，第330位异亮氨酸突变为了苏氨酸，且第129位赖氨酸突变为了谷氨酸，第220位异亮氨酸突变为了缬氨酸，第354位异亮氨酸突变为了缬氨酸，第277位异亮氨酸突变为了缬氨酸，第443位异亮氨酸突变为了缬氨酸，且第456位丝氨酸突变为了精氨酸，将其命名为m-10。

12、在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.12、seq id no.14、seq id no.16、seq id no.18、seq id no.20或seq id no.22所示。

13、在本发明的一种实施方式中，编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸分子的核苷酸序列如seq id no.1所示；编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体的核酸分子的核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.9、seq id no.11、seq idno.13、seq id no.15、seq id no.17、seq id no.19或seq id no.21所示。

14、本发明还提供了一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体的序列相似度大于60％和/或结构相似度tm值大于0.5。

15、在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体的序列相似度大于60％且结构相似度tm值大于0.5。

16、本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体；或者，所述核酸分子编码上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

17、在本发明的一种实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.3、seq idno.5、seq id no.7、seq id no.9、seq id no.11、seq id no.13、seq id no.15、seq idno.17、seq id no.19或seq id no.21所示。

18、本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒表达上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体；或者，所述重组质粒表达上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；或者，所述重组质粒携带上述核酸分子。

19、在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体包括质粒载体；所述质粒载体包括pet28a载体、pet28a-ptac载体、pet21a载体或pet20b载体。

20、本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体；或者，所述宿主细胞表达上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；或者，所述宿主细胞携带上述核酸分子；或者，所述宿主细胞携带上述重组质粒。

21、在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞、真核细胞、植物细胞或动物细胞。

22、本发明还提供了一种氧化还原反应体系，所述氧化还原反应体系包含上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体、上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、上述核酸分子、上述重组质粒和/或上述宿主细胞。

23、在本发明的一种实施方式中，所述氧化还原反应体系包含上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体、辅酶以及底物。

24、在本发明的一种实施方式中，所述氧化还原反应体系为催化葡萄糖-6-磷酸(g6p)产氢气的氧化还原反应体系或催化苯乙烯与重氮乙酸乙酯产2-苯基环丙烷-1-羧酸乙酯(环丙烷化反应)的氧化还原反应体系；所述催化葡萄糖-6-磷酸产氢气的氧化还原反应体系包含上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体、黄递酶(diaphorase，di)、氢化酶(pf.shi)、葡萄糖-6-磷酸、镁盐、锰盐、辅酶和电子传递体；所述催化苯乙烯与重氮乙酸乙酯产2-苯基环丙烷-1-羧酸乙酯的氧化还原反应体系包含上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体、氧化还原酶、苯乙烯、重氮乙酸乙酯、葡萄糖-6-磷酸和辅酶。

25、在本发明的一种实施方式中，所述镁盐包含氯化镁和/或硫酸镁；所述锰盐包含氯化锰和/或硫酸锰；所述辅酶包含天然辅酶nadp+和/或人工辅酶cnmn+；所述电子传递体为甲基紫精(mv)、中性红(nr)和/或苄基紫精(bv)；所述氧化还原酶包含细胞色素p450和/或肌红蛋白。

26、在本发明的一种实施方式中，所述催化葡萄糖-6-磷酸产氢气的氧化还原反应体系中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体的浓度为0.1～3mg/ml，黄递酶的浓度为0.1～3mg/ml，氢化酶的浓度为0.1～3mg/ml，葡萄糖-6-磷酸的浓度为1～200mm，镁盐的浓度为1～20mm，锰盐的浓度为0.01～5mm，辅酶的浓度为0.1～5mm，电子传递体的浓度为0.1～5mm。

27、在本发明的一种实施方式中，所述催化葡萄糖-6-磷酸产氢气的氧化还原反应体系中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体的浓度为1～3mg/ml，黄递酶的浓度为1～3mg/ml，氢化酶的浓度为0.1～2.5mg/ml，葡萄糖-6-磷酸的浓度为1～200mm，镁盐的浓度为1～15mm，锰盐的浓度为0.1～5mm，辅酶的浓度为0.1～5mm，电子传递体的浓度为1～5mm。

28、在本发明的一种实施方式中，所述催化葡萄糖-6-磷酸产氢气的氧化还原反应体系中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体的浓度为1～2.5mg/ml，黄递酶的浓度为1～2.5mg/ml，氢化酶的浓度为0.1～1.5mg/ml，葡萄糖-6-磷酸的浓度为1～200mm，镁盐的浓度为1～10mm，锰盐的浓度为0.1～5mm，辅酶的浓度为1～5mm，电子传递体的浓度为1～5mm。

29、本发明还提供了一种催化底物制备反应产物的方法，所述方法包括：将上述氧化还原反应体系进行反应，得到反应产物。

30、在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为10～95℃。

31、在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为20～80℃。

32、在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为50～70℃。

33、在本发明的一种实施方式中，所述催化底物制备反应产物包括催化葡萄糖-6-磷酸产氢气和/或催化苯乙烯与重氮乙酸乙酯产2-苯基环丙烷-1-羧酸乙酯。

34、本发明还提供了上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体或上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或上述核酸分子或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述氧化还原反应体系在氧化还原反应中的应用。

35、在本发明的一种实施方式中，所述氧化还原反应包括催化底物制备反应产物的氧化还原反应。

36、在本发明的一种实施方式中，所述催化底物制备反应产物的氧化还原反应包括催化葡萄糖-6-磷酸产氢气的氧化还原反应和/或催化苯乙烯与重氮乙酸乙酯产2-苯基环丙烷-1-羧酸乙酯的氧化还原反应。

37、本发明技术方案，具有如下优点：

38、本发明提供了一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，第115位丝氨酸突变为了丙氨酸、第117位丝氨酸突变为了赖氨酸、第417位酪氨酸突变为了组氨酸、第118位脯氨酸突变为了丙氨酸、第46位精氨酸突变为了天冬酰胺、第415位异亮氨酸突变为了蛋氨酸、第330位异亮氨酸突变为了苏氨酸、第129位赖氨酸突变为了谷氨酸、第220位异亮氨酸突变为了缬氨酸、第354位异亮氨酸突变为了缬氨酸、第277位异亮氨酸突变为了缬氨酸、第443位异亮氨酸突变为了缬氨酸和/或第456位丝氨酸突变为了精氨酸。仿生辅酶cnmn是一种人造辅酶因子，具有超高热稳定性优势，能够取代天然辅酶用于氧化还原反应。研究表明，与出发氨基酸序列如seq id no.2所示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相比，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体对仿生辅酶cnmn的偏好性显著提高(以cnmn+为辅酶的比酶活的提高了100～110倍，kcat/km提高了135～145倍)，这有效提高了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶利用仿生辅酶cnmn的催化能力，因此，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体在氧化还原反应(例如，催化葡萄糖-6-磷酸产氢气的氧化还原反应)中极具应用前景。