一种靶向EGFR与TF的双特异性抗体及其药物偶联物和应用的制作方法

本申请属于抗体，具体涉及一种靶向egfr与tf的双特异性抗体及其药物偶联物和应用。

背景技术：

1、抗体药物偶联物（adc）作为精准靶向治疗的“魔法子弹”，通过抗体的特异性靶向能力将细胞毒性药物精准递送至肿瘤病灶，实现对肿瘤细胞的选择性杀伤，同时降低对正常组织的毒副作用，已成为全球生物医药领域的竞技高地和肿瘤治疗的研究热点。其中抗体对肿瘤的靶向性对于adc药物的治疗功效尤为重要。

2、表皮生长因子受体（egfr）是受体酪氨酸激酶家族成员，在非小细胞肺癌、结直肠癌、头颈癌等多种恶性肿瘤中高表达，其过度激活可促进肿瘤细胞增殖、侵袭、转移及血管生成，是肿瘤治疗的经典靶点。但单一靶向egfr的治疗策略易导致肿瘤细胞产生耐药性，且部分肿瘤存在egfr低表达现象，导致单靶点adc疗效有限，难以满足临床治疗需求。组织因子（tf，又称cd142）是一种跨膜糖蛋白，其在多种恶性肿瘤（如宫颈癌、胰腺癌、肺癌、结直肠癌等）中异常高表达，与肿瘤的侵袭转移、血管生成及预后不良密切相关。双特异性抗体（bsab）可同时特异性结合两个不同的抗原靶点，相比单特异性抗体，能更精准地靶向肿瘤细胞，提升肿瘤富集效率，降低脱靶效应，同时可通过双靶点协同作用阻断肿瘤细胞的多条生存信号通路，能有效克服单靶点治疗的耐药性问题。但双特异性抗体的靶向性受单靶点抗体的自身亲和力、结合价态（avidity）以及整体结构形式的共同影响。例如，价态的增加会增强“亲合力（avidity），但在实际双特异性抗体构建时，在细胞表面，靶抗原的密度和分布是有限的。价态过高可能导致空间拥挤，使部分结合位点无法接触到抗原，造成“多价”资源浪费，实际亲合力可能并不理想。经检索目前还未有关于亲和力效果良好的靶向egfr和tf的双特异性抗体及其adc药物的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种靶向egfr与tf的双特异性抗体，能够高亲和力地同时靶向tf和egfr，可实现胰腺癌、表皮癌、结直肠癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌等的结合。

2、本发明提供了一种靶向表皮生长因子受体和组织因子的双特异性抗体，包括靶向表皮生长因子受体的重链结构、靶向表皮生长因子受体的轻链结构、靶向组织因子的重链结构、靶向组织因子的轻链结构；

3、所述靶向表皮生长因子受体的重链结构的氨基酸序列如seq id no:2所示；

4、所述靶向表皮生长因子受体的轻链结构的氨基酸序列如seq id no:4所示；

5、所述靶向组织因子的重链结构的氨基酸序列如seq id no:6所示；

6、所述靶向组织因子的轻链结构的氨基酸序列如seq id no:8所示。

7、本发明提供了所述双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：

8、构建分别表达靶向组织因子的重链结构、靶向组织因子的轻链结构、靶向表皮生长因子受体的重链结构、靶向表皮生长因子受体的轻链结构的重组载体；

9、将构建的4个重组载体共同转染至哺乳动物细胞中表达，纯化，得到双特异性抗体。

10、优选的，所述重组载体中，编码靶向表皮生长因子受体的重链结构的基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；

11、编码靶向表皮生长因子受体的轻链结构的基因的核苷酸序列如seq id no:3所示；

12、编码靶向组织因子的重链结构的基因的核苷酸序列如seq id no:5所示；

13、编码靶向组织因子的轻链结构的基因的核苷酸序列如seq id no:7所示。

14、本发明提供了所述双特异性抗体或所述制备方法制备的双特异性抗体在制备抗肿瘤的抗体偶联药物或降低抗肿瘤药物耐药性的药物中的应用。

15、优选的，所述肿瘤包括以下至少一种：胰腺癌、表皮癌、结直肠癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌。

16、优选的，所述肿瘤的宿主来源包括人和/或非人灵长类动物。

17、本发明提供了一种双特异性抗体偶联药物，包括活性药物分子和所述双特异性抗体或所述制备方法制备的双特异性抗体；

18、所述活性药物分子与所述双特异性抗体偶联连接。

19、优选的，所述活性药物包括抗肿瘤药物。

20、优选的，所述抗肿瘤药物包括以下至少一种：单甲基奥瑞他汀e（mmae）、dna拓扑异构酶i抑制剂dxd、7-乙基-10-羟基喜树碱和微管蛋白抑制剂dm1。

21、优选的，所述双特异性抗体偶联药物的dar值为4；

22、所述双特异性抗体偶联药物中通过缬氨酸-瓜氨酸将双特异性抗体和活性药物分子偶联。

23、本发明提供了一种靶向表皮生长因子受体和组织因子的双特异性抗体。将靶向组织因子抗体与靶向egfr抗体与为研究对象，建立双靶点抗体药物表达系统，获得结构稳定的双靶点抗体b835。通过种属抗原结合与亲和力检测，证实该双抗可以特异性与人源、猴源靶点结合，而与鼠源靶点不结合；亲和力检测结果显示双抗可以特异性与双靶点抗原结合，亲和力较高且与对应的单抗相比亲和力没有下降。将所述双特异性抗体制备adc，验证得到的b835-adc与肿瘤细胞表面的结合活性和内吞效应，bxpc-3（人胰腺癌细胞）calu-1、mda-mb-468、sk-br-3（人乳腺癌细胞）中，b835均可与三种肿瘤细胞表面结合，内吞效应高于单靶点抗体。细胞毒实验结果显示在b835多种肿瘤中能够抑制肿瘤胞的生长。此外，本发明还构建裸鼠cdx皮下瘤模型，肿瘤细胞模型：hct116（人结直肠癌细胞）、calu-1（人肺癌细胞）、mda-mb-231（人乳腺癌细胞）；还构建了裸鼠pdx皮下瘤模型（人乳腺癌、人肠癌与人肺癌）模型开展抗肿瘤活性实验，结果表明，b835-adc能够显著抑制肿瘤的生长，呈现剂量递增效应，优于已上市药物西妥昔单抗，设计的药物有望成为抗肿瘤药物，解决单抗adc的脱靶、抗药等问题。

1.一种靶向表皮生长因子受体和组织因子的双特异性抗体，其特征在于，包括靶向表皮生长因子受体的重链结构、靶向表皮生长因子受体的轻链结构、靶向组织因子的重链结构、靶向组织因子的轻链结构；

2.权利要求1所述双特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述双特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述重组载体中，编码靶向表皮生长因子受体的重链结构的基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；

4.权利要求1所述双特异性抗体或权利要求2或3所述制备方法制备的双特异性抗体在制备抗肿瘤的抗体偶联药物或降低抗肿瘤药物耐药性的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述肿瘤包括以下至少一种：胰腺癌、表皮癌、结直肠癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌。

6.根据权利要求4或5所述应用，其特征在于，所述肿瘤的宿主来源包括人和/或非人灵长类动物。

7.一种双特异性抗体偶联药物，其特征在于，包括活性药物分子和权利要求1所述双特异性抗体或权利要求2或3所述制备方法制备的双特异性抗体；

8.根据权利要求7所述双特异性抗体偶联药物，其特征在于，所述活性药物分子包括抗肿瘤药物。

9.根据权利要求8所述双特异性抗体偶联药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括以下至少一种：单甲基奥瑞他汀e、dna拓扑异构酶i抑制剂dxd、7-乙基-10-羟基喜树碱和微管蛋白抑制剂dm1。

10.根据权利要求7~9中任意一项所述双特异性抗体偶联药物，其特征在于，所述双特异性抗体偶联药物的dar值为4；