编码人肝细胞生长因子的核酸构建体及其应用的制作方法

本公开属于生物医药领域，尤其涉及一种编码人肝细胞生长因子（hepatocytegrowth factor, hgf）的核酸构建体及其应用。

背景技术：

1、血管生成（angiogenesis）是指由已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉生长形成新生毛细血管的过程。新生血管的生长与成熟是一个高度复杂且精密协调的生物学过程。血管的形成与发育依赖于促血管生成因子与抗血管生成因子之间的动态平衡，该过程需要细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互作用，并通过多种促血管生成因子与抗血管生成因子激活和调控一系列受体。目前已发现超过20种促血管生成因子，包括肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, hgf）、血管内皮生长因子（vegf）、碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）、血小板衍生生长因子（pdgf）等。

2、hgf最初从大鼠血浆和血小板中分离得到，是一种多功能细胞因子。已知hgf由间质细胞产生，可结合受体c-met并激活该受体的酪氨酸激酶活性，进而促进肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、黑素细胞、造血细胞等多种细胞的生长、迁移与形态发生，促进血管（如微血管）生成、促进神经损伤（如糖尿病周围神经病变等周围神经病变）修复等。因此，hgf有望被开发为用于治疗hgf/c-met相关疾病的治疗药物。

3、目前，促血管生成因子已有多种给药形式，但均存在明显缺陷：

4、（1）纯化蛋白经静脉注射后，虽可通过血液循环到达缺血组织，但机体免疫系统会对异源蛋白产生免疫应答，且注射的异源蛋白会被蛋白酶快速降解，导致治疗效果不佳；而多次在缺血区域注射生长因子则可能引发严重的不良反应。

5、（2）dna疗法无需手术，可直接将dna注射至缺血区域的肌肉组织，即原位治疗，但该方法中大量dna质粒存在于细胞外，易被降解，半衰期短、表达效率低；病毒载体转染技术虽可提高转染效率，但可能将病毒载体的核酸序列整合至宿主基因组，因此存在风险。

6、rna疗法能够避免基因组整合，但易被rna酶降解。因此，需要提高rna的稳定性，使其编码的蛋白产物在体内积累，以及在储存、施用的过程中保持rna结构和功能的完整性。已经发现天然存在的真核mrna分子中含有稳定化元件，例如，其5'端、3'端的非翻译区（utr），以及如5'帽结构或3'聚腺苷酸的其它结构特征。

7、因此，寻求设计效果更优的序列，是核酸药物研发的核心研究内容之一。

技术实现思路

1、本公开提供了一种编码人肝细胞生长因子（hhgf）的核酸构建体及其应用，该hhgf核酸构建体对应的mrna翻译效率高、免疫原性低。

2、本公开通过如下技术方案解决上述技术问题。

3、一方面，本公开提供了一种分离的编码hhgf的核酸分子，所述核酸分子包括如seqid no: 4-22任一所示的核苷酸序列。

4、所述核酸分子包括如seq id no: 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22任一所示的核苷酸序列。

5、在一些实施方案中，所述核酸分子还包括编码终止密码子的dna序列，例如tgataatag。

6、另一方面，本公开提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包括一条或多条本公开所述的核酸分子。

7、在一些实施方案中，所述核酸构建体还包括编码5'utr、3'utr和poly(a)中的一种或多种的核酸分子。

8、在一些实施方案中，编码5'utr的核酸分子的核苷酸序列如seq id no: 23所示。

9、在一些实施方案中，编码3'utr的核酸分子的核苷酸序列如seq id no: 24所示。

10、在一些实施方案中，编码poly(a)的核酸分子的核苷酸序列如seq id no: 25所示。

11、在一些实施方案中，自5'端到3'端，所述核酸构建体包括编码5'utr的核酸分子、编码hhgf的核酸分子、编码3'utr的核酸分子和编码poly(a)的核酸分子。

12、在一些实施方案中，所述核酸分子通过例如选自bsai、hind iii和sap i中的一种或多种的限制性内切酶构建至所述核酸构建体，优选地，所述核酸分子通过bsai构建至所述核酸构建体。

13、在一些实施方案中，所述核酸构建体为表达盒，所述表达盒除了含上述核酸分子外，任选地还可包括启动子、增强子等调控元件。

14、另一方面，本公开提供了一种重组载体，所述重组载体包括本公开所述的核酸分子或本公开所述的核酸构建体。

15、在一些实施方案中，所述重组载体为质粒、粘粒或病毒载体，所述病毒载体优选为噬菌体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

16、另一方面，本公开提供了一种转化体，所述转化体含有本公开所述的核酸分子、本公开所述的核酸构建体或本公开所述的重组载体。

17、在一些实施方案中，所述转化体为非动物品种或非植物品种。

18、在一些实施方案中，所述转化体的宿主细胞为真核细胞或原核细胞。

19、另一方面，本公开提供了一种mrna，所述mrna包括本公开所述的核酸分子或者本公开所述的核酸构建体编码的mrna序列或其修饰序列。

20、在一些实施方案中，所述mrna的序列是经过密码子优化的。

21、在一些实施方案中，所述mrna的序列包含至少一种碱基修饰。

22、在一些实施方案中，所述碱基修饰包括选自以下的任意一种或更多种：假尿苷、n1-甲基假尿苷、n1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-o-甲基尿苷。

23、在一些实施方案中，所述碱基修饰包括将尿苷替换为假尿苷和/或n1-甲基假尿苷。

24、在一些实施方案中，所述碱基修饰是1%～100%碱基修饰。

25、在一些实施方案中，所述碱基修饰包括将序列中的全部尿苷替换为假尿苷或n1-甲基假尿苷。在本发明一些具体实施方案中，所述碱基修饰包括将序列中的全部尿苷替换为n1-甲基假尿苷，能够显著降低外源合成mrna的免疫原性，提升翻译效率。

26、在一些实施方案中，所述mrna的5'末端连接有5'帽结构（5'cap）。

27、在一些实施方案中，所述5'帽结构为cap 0、cap 1、cap 2或其类似物。

28、在一些实施例方案中，所述5'帽结构具有式（i）所示结构：

29、

30、其中，n选自1或0；m选自1或0；

31、x1选自-c(oh)h-或单键；

32、x2选自-ch-、-o-、-cn、-c(o)-、或单键；

33、x3选自-ch2、-cfh-或-o-；

34、r1选自-oh或-nhac；

35、r2选自-ch3、-f、-h或不存在；

36、r3选自-or6、-nhc(o)r7、-n(r8)2、-cn、-f、-c(o)n(r9)2、取代或未取代的c1-c3烷基、-h或不存在；

37、r4选自-ch3、-f或-h；

38、r5选自-or10、-nhc(o)r11、-n(r12)2、-cf2h、-f、-c(o)n(r13)2、取代或未取代的c1-c3烷基或不存在；

39、r6、r8、r10、r11、r12和r13分别独立地选自未取代的c1-c3烷基或-h；

40、r7选自-or14、-nhc(o)r15、-f或取代或未取代的c1-c3烷基；

41、r9选自未取代的c2-c3烷基；

42、r14和r15分别独立地选自未取代的c1-c3烷基。

43、在一些实施方案中，所述5'帽结构的结构式如下：

44、。

45、在一些实施方案中，所述5'帽结构的结构式如下：

46、。

47、另一方面，本公开提供了一种制备mrna的方法，所述方法包括基于本公开所述的核酸分子或本公开所述的核酸构建体转录获得所述mrna。可选地，所述转录的过程包括加帽反应。

48、另一方面，本公开提供了组合物，所述组合物包括脂质纳米颗粒，以及包载于所述脂质纳米颗粒中的本公开所述的mrna。

49、在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质和辅助脂质。

50、在一些实施方案中，所述阳离子脂质为yk-009。

51、在一些实施方案中，所述辅助脂质为dspc、胆固醇和/或dmg-peg-2000。

52、在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包括所述mrna、yk-009、dspc、胆固醇和dmg-peg-2000。

53、在一些实施方案中，yk-009、dspc、胆固醇和dmg-peg-2000的摩尔比为（40~60）:（2~15）:（30~40）:（0.8~1.6），例如49:10:39.5:1.5。

54、在一些实施方案中，所述组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

55、另一方面，本公开提供了一种制备上述组合物的方法，所述方法包括：

56、将所述阳离子脂质和辅助脂质按照一定比例溶解于无水乙醇中制备有机相；

57、将所述mrna分子溶于缓冲液中形成水相；

58、将所述水相与有机相通过移液器或微流控芯片混合制备所述组合物。

59、在一些实施方案中，所述水相和所述有机相的体积比为（2~4）:1。

60、另一方面，本公开提供了本公开所述的核酸分子、所述的核酸构建体、所述的重组载体、所述的转化体、所述的mrna、所述的组合物在制备如下产品中的一种或多种的应用：

61、（1）提高hhgf表达量的产品；

62、（2）促进内皮细胞生长和/或迁移的药物；

63、（3）促血管生成的药物；

64、（4）促进神经损伤修复的药物；

65、（5）预防和/或治疗缺血性疾病、代谢综合征、糖尿病并发症、血管再狭窄，和/或，神经损伤的药物。

66、在一些实施方案中，所述缺血性疾病选自冠状动脉疾病(cad)、外周动脉疾病(pad)、心肌梗死、肢体缺血、血栓闭塞性脉管炎(tao)；优选地，所述肢体缺血为下肢缺血，更优选地，所述肢体缺血为严重下肢缺血(cli)。

67、在一些实施方案中，所述糖尿病并发症选自糖尿病周围神经病变、糖尿病足(dfu)、糖尿病性动脉硬化闭塞症(dao)。

68、在一些实施方案中，所述血管再狭窄选自经皮冠状动脉介入治疗(pci)后再狭窄、旁路移植术后再狭窄、缺血再灌注引起的血管再狭窄。

69、在一些实施方案中，所述神经损伤选自神经退行性疾病、创伤性神经损伤、周围神经病变；优选地，所述神经退行性疾病选自肌萎缩性侧索硬化(als)、帕金森氏病、阿尔茨海默病，所述周围神经病变为糖尿病周围神经病变。

70、另一方面，本公开提供了本公开所述的核酸分子、所述的核酸构建体、所述的重组载体、所述的转化体、所述的mrna、所述的组合物用于（1）提高hhgf表达量，（2）促进内皮细胞生长和/或迁移，（3）促血管生成，（4）促进神经损伤修复，和/或，（5）预防和/或治疗缺血性疾病、代谢综合征、糖尿病并发症、血管再狭窄，和/或，神经损伤。

71、在一些实施方案中，所述缺血性疾病选自冠状动脉疾病、外周动脉疾病、心肌梗死、肢体缺血、血栓闭塞性脉管炎；优选地，所述肢体缺血为下肢缺血，更优选地，所述肢体缺血为严重下肢缺血。

72、在一些实施方案中，所述糖尿病并发症选自糖尿病周围神经病变、糖尿病足、糖尿病性动脉硬化闭塞症。

73、在一些实施方案中，所述血管再狭窄选自经皮冠状动脉介入治疗后再狭窄、旁路移植术后再狭窄、缺血再灌注引起的血管再狭窄。

74、在一些实施方案中，所述神经损伤选自神经退行性疾病、创伤性神经损伤、周围神经病变；优选地，所述神经退行性疾病选自肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病，所述周围神经病变为糖尿病周围神经病变。

75、另一方面，本公开了提供了一种方法，所述方法用于（1）提高hhgf表达量，（2）促进内皮细胞生长和/或迁移，（3）促血管生成，（4）促进神经损伤修复，和/或，（5）预防和/或治疗缺血性疾病、代谢综合征、糖尿病并发症、血管再狭窄，和/或，神经损伤；

76、所述方法包括向需要的体系施用有效量的本公开所述的核酸分子、所述的核酸构建体、所述的重组载体、所述的mrna、所述的组合物。

77、在一些实施方案中，所述缺血性疾病选自冠状动脉疾病、外周动脉疾病、心肌梗死、肢体缺血、血栓闭塞性脉管炎；优选地，所述肢体缺血为下肢缺血，更优选地，所述肢体缺血为严重下肢缺血。

78、在一些实施方案中，所述糖尿病并发症选自糖尿病周围神经病变、糖尿病足、糖尿病性动脉硬化闭塞症。

79、在一些实施方案中，所述血管再狭窄选自经皮冠状动脉介入治疗后再狭窄、旁路移植术后再狭窄、缺血再灌注引起的血管再狭窄。

80、在一些实施方案中，所述神经损伤选自神经退行性疾病、创伤性神经损伤、周围神经病变；优选地，所述神经退行性疾病选自肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病，所述周围神经病变为糖尿病周围神经病变。

81、在一些实施方案中，所述体系包括细胞、组织或受试者。

82、在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人、大鼠、小鼠、猪、犬、非人灵长类，更优选人。

83、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本公开各较佳实例。

84、本公开所用试剂和原料均可商业化途径获得，或合规自制，且可重复制备。

85、本公开的积极进步效果至少包括：

86、本公开的mrna具有高翻译效率及更好的安全性，能够有效促进血管形成，显示出用于治疗缺血性疾病等的良好应用潜力。具体地：

87、本公开通过对hhgf编码序列进行密码子优化，获得了一系列具有高翻译效率的核酸分子。体外和体内实验均表明，本公开的核酸分子在细胞和小鼠肌肉组织中的hhgf蛋白表达水平较现有技术有显著提升。

88、包含本公开优化序列的mrna-lnp组合物在下肢缺血小鼠模型中展现出良好的治疗效果，单次肌肉注射给药即可显著改善患肢血流灌注、促进缺血组织血管新生。毒理学研究表明，本公开的mrna-lnp组合物在多次肌肉注射给药后没有产生明显的毒理效应，对促炎因子释放无显著影响，具有良好的安全性。

89、上述结果表明，本公开的核酸分子和组合物在缺血性疾病的治疗中具有良好的应用前景。