靶向B细胞抗原和T细胞抗原的多特异性抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及靶向b细胞抗原和t细胞抗原的多特异性抗体及其应用。

背景技术：

1、双特异性抗体是经过人工基因工程改造而成的基因工程抗体。双特异性抗体可以同时靶向两个不同的抗体结合表位，这两个表位可以来自于不同抗原，也可以来自于同一个抗原。目前的许多研究都已表明双特异性抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和病毒感染等疾病中显示了巨大的治疗潜力。与单克隆抗体相比，双特异性抗体的主要优势在于可介导两个识别表位的空间效应和双靶向的协同效用，产生两种抗体联合使用达不到的生物学效果。

2、双特异性抗体因为其不同于单克隆抗体的复杂性，技术门槛和研发成本都较高。在双特异性抗体研发中过程，需要综合考虑靶点选择、抗体工程设计和后续生产工艺等问题。在双特异性抗体构建过程中经常会遇到表达量低、稳定性差以及药效模型建立难等问题。传统抗体一般由四条链组成，两条重链和两条轻链。如果使用传统抗体来构建双特异性抗体，就会出现轻链和重链错配问题。此外，构建的双特异性抗体是否能够具备母本抗体的亲和力并且产生所需的生物学效应仍是未知的。

3、t细胞衔接器(t cell engager)是一种特殊的双特异性抗体，可以通过双特异性结合肿瘤细胞表面的靶点和t细胞，激活内源性t细胞，导致肿瘤细胞的裂解，从而达到治疗肿瘤的目的。德国micromet公司是最早开发bite(bispecific t cell engager)平台的公司之一。bite通过将两条scfv(single-chain variable fragment)用连接肽连接而成。因此，这些分子是双价的，对于每一个抗原来说是单价的，其典型的分子量在50-60kda。1998年，micromet研发出了基于bite平台的blinatumomab，此后，blinatumomab顺利完成了ⅰ期、ⅱ期和ⅲ期临床试验，成为首个获得fda批准的bite类药物。blinatumomab可以同时靶向cd19和cd3两种蛋白。cd19表达于急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤肿瘤细胞表面，作为肿瘤细胞的靶点。cd3包括多个亚基(d, g和e)，是t细胞的重要表面标志。cd3亚基可以与tcr以非共价键结合形成tcr-cd3复合物。cd3抗体一般可以识别cd3复合物的ε链，把tcr与抗原结合后产生的活化信号传递到细胞内，诱导t细胞活化，进而杀伤肿瘤细胞。t细胞衔接器已经被证明可以用来治疗肿瘤，后续针对其他靶点：cd20，bcma和cd19等靶点的t细胞细胞衔接器都已经处在临床研究阶段。这些靶点除了在肿瘤治疗领域得到很好的利用，在自身免疫性疾病（系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和多发性硬化等疾病），尤其是b细胞起主要作用的自身免疫性疾病中，具有广泛的应用场景。

4、但是目前的双特异性抗体或者多特异性抗体结构复杂，制备困难，生产成本高。此外靶向两个靶点难以应对复杂疾病，如自身免疫病和肿瘤等。因此，本领域需要开发靶向多个抗原的新结构抗体以及多特异性的t细胞衔接器。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供靶向b细胞抗原和t细胞抗原的多特异性抗体及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供了一种抗bcma的单域抗体，所述单域抗体的vhh链具有选自下组的互补决定区cdr：

3、1）seq id no: 7所示的cdr1，seq id no: 8所示的cdr2，和seq id no: 9所示的cdr3；

4、2）seq id no: 10所示的cdr1，seq id no: 11所示的cdr2，和seq id no: 12所示的cdr3；

5、3）seq id no: 7所示的cdr1，seq id no: 13所示的cdr2，和seq id no: 14所示的cdr3；

6、4）seq id no: 10所示的cdr1，seq id no: 15所示的cdr2，和seq id no: 16所示的cdr3；

7、5）seq id no: 17所示的cdr1，seq id no: 18所示的cdr2，和seq id no: 19所示的cdr3；

8、6）seq id no: 20所示的cdr1，seq id no: 21所示的cdr2，和seq id no: 22所示的cdr3；

9、7）seq id no: 1所示的cdr1，seq id no: 2所示的cdr2，和seq id no: 3所示的cdr3；和

10、8）seq id no: 4所示的cdr1，seq id no: 5所示的cdr2，和seq id no: 6所示的cdr3。

11、在另一优选例中，所述的单域抗体vhh链的cdr区包含与上述序列中任一具有至少80%、优选地至少90%、更优选地至少95%的序列相似性的氨基酸序列。

12、在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留bcma结合亲和力的衍生序列。

13、在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-3个，较佳地为1-2个，更佳地为1个。

14、在另一优选例中，所述单域抗体的vhh链还包括框架区(fr)。

15、在另一优选例中，所述的cdr1、cdr2和cdr3由vhh链的框架区fr1、fr2、fr3和fr4所隔开。

16、在另一优选例中，所述的框架区fr为人源、鼠源、兔源或骆驼源的。

17、在另一优选例中，所述单域抗体的vhh链具有与seq id no: 23-30中任一项所示的氨基酸序列同源性≥85%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、或≥99%的氨基酸序列。

18、在另一优选例中，所述单域抗体的vhh链具有一条或多条如seq id no: 23-30中任一项所示（较佳地，如seq id no: 25-30中任一项所示）的氨基酸序列。

19、在另一优选例中，所述单域抗体为单体、二价体(二价抗体)、或多价体(多价抗体)。

20、在另一优选例中，所述单域抗体的vhh链的氨基酸序列如seq id no: 23-30中任一项所示；较佳地，如seq id no: 25-30中任一项所示。

21、在本发明的第二方面，提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包括如本发明第一方面所述的抗bcma单域抗体。

22、在另一优选例中，所述的多特异性抗体为t细胞衔接器，其进一步包含特异性结合t细胞的抗原结合片段。

23、在另一优选例中，所述的多特异性抗体进一步包含特异性结合其他肿瘤抗原的抗原结合片段。

24、在另一优选例中，所述的多特异性抗体为三特异性抗体，所述三特异性抗体包括：

25、1）cd20靶向结合域，其包含一个或多个抗cd20的抗体或抗原结合片段；

26、2）bcma靶向结合域，其包含一个或多个所述的抗bcma单域抗体；和

27、3）cd3靶向结合域，其包含一个或多个抗cd3的抗体或抗原结合片段。

28、在另一优选例中，所述的三特异性抗体包含重链1、重链2和轻链。

29、在另一优选例中，所述的三特异性抗体包含两条相同的轻链。

30、在另一优选例中，所述的重链1包含抗cd20抗体的重链；重链2包含抗cd3抗体的重链和所述的抗bcma单域抗体；轻链包含抗cd20抗体的轻链，

31、较佳地，重链2中，所述的抗bcma单域抗体通过接头连接于抗cd3抗体重链的n端。

32、在另一优选例中，所述的重链1包含抗cd20抗体的重链和所述的抗bcma单域抗体；重链2包含抗cd3抗体的重链和所述的抗bcma单域抗体；轻链包含抗cd20抗体的轻链，

33、较佳地，重链1中，所述的抗bcma单域抗体通过接头连接于抗cd20抗体重链的n端；重链2中，所述的抗bcma单域抗体通过接头连接于抗cd3抗体重链的n端。

34、在另一优选例中，所述的重链1包含抗cd20抗体的重链；重链2包含抗cd3抗体的重链；轻链包含抗cd20抗体的轻链和所述的抗bcma单域抗体，

35、较佳地，轻链中，所述的抗bcma单域抗体通过接头连接于抗cd20抗体轻链的n端。

36、在另一优选例中，所述的抗cd20抗体重链氨基酸序列如seq id no: 31所示。

37、在另一优选例中，所述的抗cd3抗体重链氨基酸序列如seq id no: 32所示。

38、在另一优选例中，所述的抗cd20抗体轻链氨基酸序列如seq id no: 33或34所示。

39、在另一优选例中，所述的抗bcma单域抗体氨基酸序列如seq id no: 25-30中任一项所示。

40、在另一优选例中，所述的接头氨基酸序列如ggggs（seq id no: 35）所示。

41、在另一优选例中，所述的多特异性抗体由以下（1）-（18）中任一项所示的重链1、重链2和轻链组成：

42、（1） seq id no: 36所示的重链1，seq id no: 42所示的重链2，和seq id no: 33所示的轻链；

43、（2） seq id no: 37所示的重链1，seq id no: 43所示的重链2，和seq id no: 33所示的轻链；

44、（3） seq id no: 38所示的重链1，seq id no: 44所示的重链2，和seq id no: 33所示的轻链；

45、（4） seq id no: 39所示的重链1，seq id no: 45所示的重链2，和seq id no: 33所示的轻链；

46、（5） seq id no: 40所示的重链1，seq id no: 46所示的重链2，和seq id no: 33所示的轻链；

47、（6） seq id no: 41所示的重链1，seq id no: 47所示的重链2，和seq id no: 33所示的轻链；

48、（7） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 32所示的重链2，和seq id no: 48所示的轻链；

49、（8） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 32所示的重链2，和seq id no: 49所示的轻链；

50、（9） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 32所示的重链2，和seq id no: 50所示的轻链；

51、（10） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 32所示的重链2，和seq id no:51所示的轻链；

52、（11） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 32所示的重链2，和seq id no:52所示的轻链；

53、（12） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 32所示的重链2，和seq id no:53所示的轻链；

54、（13） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 42所示的重链2，和seq id no:33所示的轻链；

55、（14） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 43所示的重链2，和seq id no:33所示的轻链；

56、（15） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 44所示的重链2，和seq id no:33所示的轻链；

57、（16） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 45所示的重链2，和seq id no:33所示的轻链；

58、（17） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 46所示的重链2，和seq id no:33所示的轻链；

59、（18） seq id no: 31所示的重链1，seq id no: 47所示的重链2，和seq id no:33所示的轻链。

60、在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如本发明第一方面所述的抗bcma的单域抗体、或如本发明第二方面所述的多特异性抗体、或其组合。

61、在另一优选例中，所述多核苷酸包括dna、rna或cdna。

62、在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸。

63、在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

64、在另一优选例中，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、aav病毒、逆转录病毒。

65、在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸。

66、在另一优选例中，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

67、在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。

68、在本发明的第六方面，提供了一种产生如本发明第一方面所述的抗bcma的单域抗体或如本发明第二方面所述的多特异性抗体的方法，包括步骤：

69、(a) 在适合产生抗体的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含有所述抗bcma单域抗体或多特异性抗体的培养物；以及

70、(b) 从所述培养物中分离或回收所述的抗bcma单域抗体或多特异性抗体；和

71、(c) 任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的抗bcma单域抗体或多特异性抗体。

72、在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：

73、(a) 如本发明第一方面所述的抗bcma单域抗体、或如本发明第二方面所述的多特异性抗体；和

74、(b) 所述单域抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、或其组合。

75、在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，含有：

76、(i) 如本发明第一方面所述的抗bcma单域抗体、或如本发明第二方面所述的多特异性抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物、或其组合；和

77、(ii)药学上可接受的载体。

78、在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有治疗肿瘤和/或自身免疫病的其他药物，如细胞毒性药物。

79、在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

80、在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤和/或自身免疫病的药物。

81、在另一优选例中，所述的肿瘤为bcma和/或cd20高表达的肿瘤。

82、在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：多发性骨髓瘤、淋巴细胞白血病、淋巴瘤、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、结直肠癌、乳腺癌、胆囊癌、胃癌、肝癌、肾癌、头颈部肿瘤、脑部肿瘤、胶质母细胞瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、肉瘤、或其组合。

83、在另一优选例中，所述的自身免疫病选自下组：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、强直性脊柱炎、免疫性血小板减少症、特发性炎症性肌病、系统性硬化症、视神经脊髓炎谱系障碍、重症肌无力、多发性硬化症、乳糜泻、1型糖尿病、弥漫性毒性甲状腺肿（另称格雷夫斯症）、炎症性肠病、自身免疫性肝炎、或其组合。

84、在本发明的第九方面，提供了一种活性成分的用途，所述的活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗bcma单域抗体、或如本发明第二方面所述的多特异性抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物、或其组合，所述活性成分用于(a)制备检测试剂、检测板或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗疾病的药物。

85、在另一优选例中，所述检测试剂、检测板或试剂盒用于：

86、(1)检测样品中的bcma蛋白；和/或

87、(2)检测表达bcma蛋白的肿瘤细胞。

88、在另一优选例中，所述的检测试剂、检测板或试剂盒用于诊断bcma相关疾病。

89、在另一优选例中，所述的疾病为bcma和/或cd20高表达的肿瘤或者自身免疫病。

90、在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：多发性骨髓瘤、淋巴细胞白血病、淋巴瘤、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、结直肠癌、乳腺癌、胆囊癌、胃癌、肝癌、肾癌、头颈部肿瘤、脑部肿瘤、胶质母细胞瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、肉瘤、或其组合。

91、在另一优选例中，所述的自身免疫病选自下组：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、强直性脊柱炎、免疫性血小板减少症、特发性炎症性肌病、系统性硬化症、视神经脊髓炎谱系障碍、重症肌无力、多发性硬化症、乳糜泻、1型糖尿病、弥漫性毒性甲状腺肿（另称格雷夫斯症）、炎症性肠病、自身免疫性肝炎、或其组合。

92、在本发明的第十方面，提供了一种检测样品中bcma蛋白的方法，所述方法包括步骤：

93、(1) 将样品与如本发明第一方面所述的抗bcma单域抗体接触；

94、(2) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在bcma蛋白。

95、在本发明的第十一方面，提供了一种治疗与bcma相关的疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用如本发明第一方面所述的抗bcma单域抗体、如本发明第二方面所述的多特异性抗体、如本发明第七方面所述的免疫偶联物、或如本发明第八方面所述的药物组合物。

96、在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。

97、在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物（如鼠、兔）、非人灵长类动物（如猴）。

98、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。