一种针对人NECTIN4蛋白和人TGF-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体及其应用。

背景技术：

1、肿瘤作为严重威胁人类的生命健康的疾病，近年来全球肿瘤的发生率不断上升。目前，针对单一靶点的疗法（如抗nectin4 adc或tgf-ß抑制剂）在疗效上常面临肿瘤异质性、信号代偿和免疫抑制微环境重塑等挑战。例如，单纯抑制tgf-ß1信号可能不足以根除肿瘤，且可能带来全身性副作用。

2、nectin-4是一种免疫球蛋白超家族细胞黏附分子，在多种实体瘤中高度表达，包括尿路上皮癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及卵巢癌等。针对nectin-4的抗体能够特异性识别肿瘤细胞并实现靶向治疗，因此成为重要的抗肿瘤靶点。

3、tgf-β是一类具有重要免疫调节作用的细胞因子，其在肿瘤微环境中通常呈高表达状态，并通过抑制效应t细胞、促进调节性t细胞以及诱导肿瘤相关成纤维细胞等机制促进肿瘤免疫逃逸。因此，阻断tgf-β信号通路被认为是一种重要的抗肿瘤免疫治疗策略。

4、现有技术中，肿瘤靶向抗体和免疫调节抗体通常需要联合使用，但联合疗法可能导致药代动力学差异、剂量优化困难以及成本增加。因此，开发能够同时靶向肿瘤抗原及免疫抑制因子的双特异性抗体具有重要意义。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的是提供一种针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体及其应用，通过nectin4蛋白结合区和tgf-ß1蛋白结合区精准导向并抑制肿瘤细胞。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体，包括人源化igg亚型抗体和vhh单域抗体片段，所述vhh单域抗体片段通过连接肽融合至所述人源化igg亚型抗体的每条重链的c末端，所述人源化igg亚型抗体为nectin4蛋白结合区，所述vhh单域抗体片段为tgf-ß1蛋白结合区。

4、其中，所述vhh单域抗体片段通过连接肽融合至所述人源化igg亚型抗体的每条重链的c末端后的序列如seq id no：4所示。

5、基于上述技术方案，进一步地，所述人源化igg亚型抗体由两条重链和两条轻链组成；

6、所述重链包括序列如seq id no：11所示的重链可变区互补决定区a、序列如seqid no：12所示的重链可变区互补决定区b、序列如seq id no：13所示的重链可变区互补决定区c；

7、所述轻链包括序列如seq id no：21所示的轻链可变区互补决定区a、序列如seqid no：22所示的轻链可变区互补决定区b、序列如seq id no：23所示的轻链可变区互补决定区c；

8、所述重链可变区互补决定区a、b和c与轻链可变区互补决定区a、b和c结合构成针对人nectin4蛋白的结合点位，所述vhh单域抗体片段中的序列如seq id no：31所示的可变区互补决定区d、序列如seq id no：32所示的可变区互补决定区e和序列如seq id no：33所示的可变区互补决定区f构成针对人tgfß1蛋白的结合点位。

9、基于上述技术方案，进一步地，所述重链序列如seq id no：1所示，所述轻链序列如seq id no：2所示，所述vhh单域抗体片段序列如seq id no：3所示。

10、其中，具备同等结合活性的保守突变序列也纳入本保护范围。与前述序列同源性≥90%且保留双靶点结合功能的变体序列，均属于本保护范畴。

11、基于上述技术方案，进一步地，与nectin4蛋白的结合亲和力kd介于1e-8和1e-11之间，与tgf-ß1蛋白的结合亲和力kd介于1e-5和1e-8之间；所述连接肽为柔性肽接头，所述柔性肽接头的序列为(ggggs)n，所述n为1-10。

12、基于上述技术方案，进一步地，所述n为2-5。

13、基于上述技术方案，进一步地，所述n为3。

14、第二方面，本发明提供一种核酸分子，编码如权利要求1至4任一项所述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体。

15、第三方面，本发明提供上述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体在制备用于与nk细胞联合治疗肿瘤的药物中的应用。

16、第四方面，本发明提供上述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体在制备tgf-ß1抑制剂中的应用。

17、第五方面，本发明提供上述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

18、第六方面，本发明提供上述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体在制备nectin4抑制剂中的应用。

19、第七方面，本发明提供上述的针对一种抗体药物偶联物的应用，其特征在于，包含如权利要求1至4任一项所述的双特异性抗体以及细胞毒性药物，所述双特异性抗体通过连接子与所述细胞毒性药物偶联。

20、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

21、1.本发明提供的抗体包括特异性结合nectin-4的人源化igg抗体以及特异性结合tgf-β1的单域抗体（vhh），其中vhh通过连接肽与所述igg抗体融合。vhh通过柔性连接肽连接于igg抗体重链的c末端，连接肽包括甘氨酸-丝氨酸重复序列。所述双特异性抗体能够同时结合nectin-4和tgf-β1，一方面通过nectin-4实现对肿瘤细胞的特异性靶向，另一方面通过结合并中和tgf-β1抑制肿瘤微环境中的免疫抑制信号，从而增强抗肿瘤免疫反应。在肿瘤微环境中同时实现肿瘤靶向及免疫抑制解除，保留igg抗体的稳定性及长半衰期，在肿瘤免疫治疗领域具有重要应用价值。

22、2.本发明还提供编码所述抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞、制备方法以及其在制备用于治疗肿瘤疾病药物中的用途。本发明的双特异性抗体具有结构稳定、靶向性强及潜在治疗效果优良等优点，在肿瘤免疫治疗领域具有良好的应用前景。

1.一种针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体，其特征在于，包括人源化igg亚型抗体和vhh单域抗体片段，所述vhh单域抗体片段通过连接肽融合至所述人源化igg亚型抗体的每条重链的c末端，所述人源化igg亚型抗体为nectin4蛋白结合区，所述vhh单域抗体片段为tgf-ß1蛋白结合区。

2.根据权利要求1所述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体，其特征在于，所述人源化igg亚型抗体由两条重链和两条轻链组成；

3. 根据权利要求1所述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体，其特征在于，所述重链序列如seq id no：1所示，所述轻链序列如seq id no：2所示，所述vhh单域抗体片段序列如seq id no：3所示。

4.根据权利要求1所述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体，其特征在于，与nectin4蛋白的结合亲和力kd介于1e-8和1e-11之间，与tgf-ß1蛋白的结合亲和力kd介于1e-5和1e-8之间；所述连接肽为柔性肽接头，所述柔性肽接头的序列为(ggggs)n，所述n为1-10。

5.一种核酸分子，其特征在于，编码如权利要求1至4任一项所述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体。

6.根据权利要求1至4任一项所述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体在制备用于与nk细胞联合治疗肿瘤的药物中的应用。

7.如权利要求1至4任一项所述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体在制备tgf-ß1拮抗剂中的应用。

8.如权利要求1至4任一项所述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.如权利要求1至4任一项所述的针对人nectin4蛋白和人tgf-ß1蛋白的重组人源化双特异性抗体在制备nectin4拮抗剂中的应用。

10.一种抗体药物偶联物，其特征在于，包含如权利要求1至4任一项所述的双特异性抗体以及细胞毒性药物，所述双特异性抗体通过连接子与所述细胞毒性药物偶联。