一种以粉蝶霉素或粉蝶霉素糖苷衍生物为底物的多功能糖基转移酶及应用的制作方法

本发明属于基因工程、生物催化与药物生物，涉及以药物分子为底物的糖基化修饰，具体涉及一种以粉蝶霉素或粉蝶霉素糖苷衍生物为底物的多功能糖基转移酶及应用。

背景技术：

1、粉蝶霉素（piericidins）是由放线菌产生的具有4-羟基吡啶母核和多甲基化侧链的i型聚酮类微生物次级代谢产物。上世纪60年代首个粉蝶霉素化合物piericidin a从土壤来源的链霉菌

streptomyces mobaraensis中发现。粉蝶霉素糖苷（gpas）则是粉蝶霉素的糖基化衍生物，其中最常见的糖基化位点位于粉蝶霉素c4'和c10位的羟基，并且可多位点同时发生糖基化。

streptomyces psammoticus ns126是可生产粉蝶霉素及粉蝶霉素糖苷的海洋放线菌，目前已从中已鉴定发现的粉蝶霉素糖苷有近三十种（journal of medicinalchemistry, 2019, 62:7058）。

2、糖基化修饰的粉蝶霉素糖苷比粉蝶霉素苷元类分子有更好的药效活性，更低的毒性以及更高的生物利用度（journal of medicinal chemistry. 2021, 64, 9943；chinesejournal of natural medicines, 2025. 23:614），尤其是13位羟基取代的粉蝶霉素糖苷13-hydroxyglucopiericidin a在肾脏疾病治疗方向具有重要的药用开发潜力（actapharmaceutica sinica b 2024, 14, 3232）。但是，粉蝶霉素糖苷尚未能形成较完善成熟的产业体系，生产过程还主要依赖少数几种自身可产生粉蝶霉素糖苷的野生型菌株。优良的粉蝶霉素糖苷专用生产菌株有待进一步开发，其中糖基化的定向催化是亟需解决的问题。

技术实现思路

1、针对粉蝶霉素或其糖苷衍生物糖基化修饰不明的问题，本发明提供了一种以粉蝶霉素或粉蝶霉素糖苷衍生物为底物的多功能糖基转移酶及应用。该糖基转移酶piesgt1来自海洋链霉菌

streptomyces psammoticus scsio ns126（zl202410857442.1），能以粉蝶霉素或其糖苷衍生物为底物，使用udp-葡萄糖为配体并在c4'、c10位的羟基上催化糖基化反应。本发明通过蛋白表达纯化大规模制备piesgt1并在体外催化粉蝶霉素或其糖苷衍生物发生糖基化，同时还可将piesgt1异源表达于粉蝶霉素苷元生产菌

kitasatospora hibiscihnm1077（xiao j ,lin y ,luo s , et al.

kitasatospora hibisci sp. nov., a novelactinomycete with antimicrobial potential isolated from rhizosphere soil ofhibiscus tiliaceus in guangxi.[j].international journal of systematic andevolutionary microbiology,2025,75(5):doi:10.1099/ijsem.0.006787，该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号：cctcc[aa2024052]；该菌株本技术人也持有，并保证自申请日起20年内向公众发放）中，实现了粉蝶霉素糖苷的定向生产。

2、本发明是通过以下技术方案予以实现的：

3、本发明的第一个目的是提供一种可使用udp-葡萄糖并在粉蝶霉素或其糖苷衍生物c4'、c10位的羟基上催化糖基化反应的糖基转移酶piesgt1，其氨基酸序列为如下任一种：

4、（a）如seq id no.1所示的氨基酸序列；

5、（b）在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，经一个或多个氨基酸的取代、插入或缺失，具有催化粉蝶霉素或其糖苷衍生物发生糖基化反应活性的氨基酸序列；

6、（c）与seq id no.1所示氨基酸序列具有至少85%序列同源性，且具有催化粉蝶霉素或其糖苷衍生物发生糖基化反应活性的氨基酸序列。

7、本发明的第二个目的是提供编码上述糖基转移酶piesgt1的核酸。

8、优选，所述核酸的核苷酸序列为如下任一种：

9、（a）如seq id no.2所示的核苷酸序列；

10、（b）在seq id no.2所示核苷酸序列的基础上，经一个或多个核苷酸的取代、插入或缺失，且编码上述糖基转移酶piesgt1的核苷酸序列；

11、（c）与seq id no.2所示核苷酸序列具有至少85%序列同源性，且编码上述糖基转移酶piesgt1的核苷酸序列；

12、（d）与（a）-（c）中任一项所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。

13、本发明的第三个目的是提供一种含有上述核酸的重组表达载体。

14、优选，所述重组表达载体以pet28a为骨架构建（pet28a- piesgt1）。

15、优选，所述重组表达载体以pset152为骨架构建（pset152-

kaso*p-piesgt1）。

16、在本发明的一种实施例中，将上述核苷酸序列克隆插入适用于大肠杆菌异源表达的载体骨架中，构建含有糖基转移酶piesgt1编码序列的重组表达载体。将重组表达载体导入大肠杆菌宿主细胞使piesgt1表达，并通过细胞破碎、蛋白纯化及浓缩等方法获得糖基转移酶。

17、在本发明的另一种实施例中，将上述核苷酸序列克隆插入适用于

kitasatospora

hibisci表达的载体骨架中，构建含有糖基转移酶piesgt1编码序列的重组表达载体。将重组表达载体导入

kitasatospora hibisci hnm1077，通过发酵培养，使宿主表达piesgt1并催化粉蝶霉素或其糖苷衍生物发生糖基化反应。

18、本发明的第四个目的是提供一种重组宿主细胞，包含上述的核酸或重组表达载体。

19、优选，所述重组宿主细胞以bl21(de3)为宿主菌株。

20、优选，所述重组宿主细胞以

kitasatospora hibisci hnm1077为宿主菌株。

21、本发明的第五个目的是提供一种体外催化粉蝶霉素或其糖苷衍生物糖基化的方法，包括以下步骤：将上述糖基转移酶piesgt1与粉蝶霉素或其糖苷衍生物进行糖基化反应，获得糖基化产物。

22、优选，所述糖基化反应的糖基供体为udp-葡萄糖。

23、优选，所述糖基化反应条件为：25-35℃反应0.5-1.5 h。

24、优选，所述粉蝶霉素或其糖苷衍生物选自piericidin a、glucopiericidin a、13-hydroxyglucopiericidin a中的一种或多种。

25、优选，所述糖基化反应的体系为：50 mm tris-hcl（ph 8.0）77 μl；100 mm mgcl210 μl；30 mm底物（粉蝶霉素或其糖苷衍生物）4 μl；100 mm udp-葡萄糖4 μl；纯化piesgt1蛋白5 μl；反应温度：30℃；反应时间：1 h。

26、优选，所述糖基化反应是在粉蝶霉素或其糖苷衍生物c4'、c10位的羟基上反应。

27、本发明的第六个目的是提供一种利用重组宿主细胞催化粉蝶霉素或其糖苷衍生物糖基化的方法，包括以下步骤：培养上述的重组宿主细胞，使粉蝶霉素或其糖苷衍生物发生糖基化反应，获得糖基化产物。

28、优选，所述重组宿主细胞以

kitasatospora hibisci hnm1077为宿主菌株。

29、优选，所述粉蝶霉素或其糖苷衍生物由重组宿主细胞产生，或由培养体系外源添加。

30、优选，所述培养在isp 2培养基（酵母浸粉4 g；麦芽浸粉10 g；葡萄糖4 g；去离子水1000 ml）中进行，220 rpm摇瓶培养，培养温度为25-35℃，培养时间5~7 d。

31、优选，所述粉蝶霉素或其糖苷衍生物选自piericidin a、glucopiericidin a、13-hydroxyglucopiericidin a中的一种或多种。

32、本发明的第七个目的是提供上述糖基转移酶piesgt1、编码糖基转移酶piesgt1的核酸、重组表达载体或重组宿主细胞在催化粉蝶霉素或其糖苷衍生物糖基化中的应用。

33、相较现有技术而言，本发明的有益效果是：

34、1.本发明提供了一种来自

streptomyces psammoticus scsio ns126的多功能糖基转移酶piesgt1，piesgt1以粉蝶霉素或其糖苷衍生物为底物，udp-葡萄糖为配体，在底物c4'、c10位的羟基上持续催化糖基化反应。

35、2. 本发明通过构建含有piesgt1编码基因的异源表达体系，实现了piesgt1蛋白的有效表达，并利用piesgt1蛋白催化粉蝶霉素或其糖苷衍生物发生糖基化反应，填补了该类化合物持续糖基化反应的空白，为粉蝶霉素糖苷类物质的体外大规模化制备奠定基础。

36、3. 本发明通过构建异源表达工程菌，实现了粉蝶霉素糖苷类物质的微生物合成，为粉蝶霉素糖苷细胞工厂的开发奠定基础。