糖基转移酶突变体、核酸、重组表达载体及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程，尤其是涉及糖基转移酶突变体、核酸、重组表达载体及其应用。具体地，本发明涉及糖基转移酶突变体，编码所述糖基转移酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，重组糖基转移酶催化剂，以及糖基转移酶突变体或糖基转移酶催化剂在制备莱鲍迪苷d中的应用。

背景技术：

1、莱鲍迪苷d（rebaudioside d，简称reb d）是甜叶菊（stevia rebaudianabertoni）叶片中提取的一种四环二萜类糖苷化合物，属于甜菊糖苷家族的重要成员。其化学结构以甜菊醇（steviol）为苷元，在c19位连接由葡萄糖基和鼠李糖基构成的三糖链（glc-β(1→2)-glc-β(1→3)-glc），在c13位连接由两分子葡萄糖构成的双糖链（glc-β(1→2)-glc）。莱鲍迪苷d的甜度约为蔗糖的200-300倍，且在高浓度下仍保持纯净的甜味特征，后苦味和金属余味显著低于莱鲍迪苷a等早期甜菊糖苷。

2、作为新一代高甜度、低热量的天然甜味剂，莱鲍迪苷d在食品、饮料、制药及保健品行业中展现出巨大应用潜力。与莱鲍迪苷a相比，莱鲍迪苷d具有更优的感官特性：其甜味启动更快，持续时间更适中，与酸味剂、香料配伍性更佳。临床研究显示，莱鲍迪苷d不参与人体代谢，对血糖水平无影响，适用于糖尿病患者及体重管理人群。近年来，随着全球“减糖运动”的推进，天然高效甜味剂市场需求快速增长。然而，甜叶菊中莱鲍迪苷d天然含量极低（干叶中约0.1%-0.3%），从植物中直接提取成本高昂、产率有限，且受种植条件制约，难以满足工业化需求。因此，开发高效的莱鲍迪苷d合成技术成为产业界的迫切需求。

3、以前有研究通过化学法合成莱鲍迪苷d，以甜菊醇或莱鲍迪苷a为起始物，通过多步化学反应逐步引入特定糖基。该方法需使用大量有毒试剂（如重金属催化剂、卤代糖供体），且糖基化反应区域选择性和立体选择性控制困难，常产生异构体副产物。生物合成法具有反应条件温和、对环境友好、产物光学纯度高、无需用到有毒化学试剂等优点，具有良好的工业应用前景。

4、以糖基转移酶为催化剂将甜叶菊中含量较高的莱鲍迪苷a为底物催化合成莱鲍迪苷d被认为是一种可行的提高莱鲍迪苷d生产量的技术路线。目前野生型糖基转移酶对莱鲍迪苷a的催化活性低，在反应中的热稳定性差。

5、中国专利cn114164191a公开了枯草芽孢杆菌来源糖基转移酶yojk突变体yojk-i241t/g327n，能够催化莱鲍迪苷a转化生成莱鲍迪苷d，但是该方案仅在摇瓶小试体系验证，缺少高底物浓度发酵放大数据。

6、中国专利cn116064454a公开了热稳定性和活力提高的糖基转移酶yojk衍生突变体，能够催化莱鲍迪苷a转化生成莱鲍迪苷d，但是在24g/l莱鲍迪苷a底物条件下转化率仅达87.7%，底物负荷限制。

7、因此，还需要开发催化性能更好的酶催化剂，以满足工业化生的技术需求。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了克服现有糖基转移酶存在对莱鲍迪苷a的催化活性低，在反应中的热稳定性差的问题，而提供糖基转移酶突变体、核酸、重组表达载体及其应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的技术方案之一是：提供一种糖基转移酶yojk突变体，其为如seq id no.2所示的氨基酸序列中下述位点发生突变后所形成的突变体：第18位丝氨酸、第37位缬氨酸、第63位甘氨酸、第70位谷氨酸、第75位苏氨酸、第81位苯丙氨酸、第84位丙氨酸、第129位苏氨酸、第142位甲硫氨酸、第240位苏氨酸、第244位天冬酰胺、第324位脯氨酸、第332位缬氨酸、和第347位赖氨酸中的一个或多个的组合，且糖基转移酶突变体具有氨基酸序列如seqid no.2所示的糖基转移酶的功能。

4、本发明所述糖基转移酶将编码糖基转移酶yojk来源于枯草芽孢杆菌属(

bacillus

subtilis)。所述糖基转移酶yojk的氨基酸序列如seq id no.2所示。制备本发明所述糖基转移酶的方法包括但不限于：1)从枯草芽孢杆菌属(

bacillus subtilis)细胞中直接提取分离获得；2)按照本领域常规技术通过所述糖基转移酶编码基因的异源重组表达来获得。

5、糖基转移酶yojk的氨基酸序列具体如下：

6、manvlmigfpgeghinpsigvmkelksrgenityyavkeykekitaldiefreyhdfrgdyfgknatgdeerdftemlcaflkackdiathiyeevkhesydyviydhhllagkvianmlklprfslcttfamneefakemmgaymkgsledsphyesyqqlaetlnadfqaeikkpfdvfladgdltivftsrgfqplaeqfgeryvfvgpsiteragnndfpfdqidnenvlfismgtifnnqkqffnqclevckdfdgkvvlsigkhiktselndipenfivrpyvpqleilkraslfvthggmnstseglyfetplvvipmggdqfvvadqvekvgagkvikkeelsesllketiqevmnnrsyaekakeigqslkaaggskkaadsileavkqktqsana(seq id no.2)

7、从枯草芽孢杆菌属(

bacillus subtilis)中克隆得到新的糖基转移酶基因，其核苷酸序列分别如seq id no.1所示。示例的，枯草芽孢杆菌属(

bacillus subtilis)的基因组dna为模板，采用本领域常规技术方法(如聚合酶链式反应pcr)，获得编码所述糖基转移酶的完整核酸分子。

8、糖基转移酶yojk编码基因的核苷酸序列具体如下：

9、atggctaatgtattaatgatcggtttccccggtgaagggcatattaatccctctatcggtgtgatgaaggagctgaaatcccggggagaaaacattacgtactacgcagtgaaggaatataaagaaaaaatcacagctcttgatatagagtttcgtgagtatcatgatttcagaggagattacttcgggaaaaacgcaaccggcgatgaagaaagagatttcacagaaatgctctgcgcttttttgaaagcctgtaaggatatcgcgactcatatttatgaggaagtcaaacatgaatcgtatgattatgtcatatatgatcaccatcttctcgcgggtaaagtcattgccaacatgctgaagctgccaagattttcattgtgtacaacctttgcgatgaatgaggaatttgcgaaggaaatgatgggagcgtacatgaaaggatcacttgaagattcgcctcattatgaatcataccagcagcttgcagaaacgttaaatgctgattttcaagcagagatcaagaagccatttgatgtttttttagctgatggtgacttgacaatcgtctttacatcaaggggatttcagccactggctgagcaatttggcgagcgatatgtatttgtcggtccttccattacagaaagagccggaaacaatgatttcccatttgatcagattgacaatgaaaacgtgctgtttatttcaatgggaaccatttttaataatcaaaagcagttttttaatcaatgccttgaagtgtgtaaggactttgacggtaaagttgtgctttccatcggcaagcatattaaaacaagtgagttaaacgacattccggagaatttcattgtacgcccgtatgtccctcagcttgagatcttgaaaagagccagcttatttgtgacccacggcggaatgaacagcacaagtgaaggtttgtattttgaaaccccgctcgttgtcattccgatgggaggcgaccaatttgttgtcgcagatcaggtagaaaaagtcggcgcaggaaaagtaattaaaaaggaagaattgtctgaaagcctactgaaagagacgatacaagaagtaatgaataatcgttcgtatgctgaaaaggcaaaagaaattggacaatcactgaaagcggcaggcggctctaaaaaagcagccgacagcattcttgaagctgtaaaacaaaaaactcaatcagcaaatgcatag(seq id no.1)

10、进一步地，所述糖基转移酶突变体的氨基酸序列选择如下中的一种：

11、a）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第18位丝氨酸替换为缬氨酸；

12、b）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第18位丝氨酸替换为缬氨酸，第37位缬氨酸替换为脯氨酸；

13、c）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第18位丝氨酸替换为缬氨酸，第63位甘氨酸替换为亮氨酸，第81位苯丙氨酸替换为甲硫氨酸；

14、d）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第18位丝氨酸替换为缬氨酸，第70位谷氨酸替换为缬氨酸，第75位苏氨酸替换为缬氨酸，第84位丙氨酸替换为亮氨酸，第240位苏氨酸替换为天冬氨酸，第324位脯氨酸替换为亮氨酸，第332位缬氨酸替换为半胱氨酸，第347位赖氨酸替换为苯丙氨酸；

15、e）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第63位甘氨酸替换为亮氨酸，第75位苏氨酸替换为缬氨酸，第84位丙氨酸替换为亮氨酸；

16、f）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第70位谷氨酸替换为缬氨酸；

17、g）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第70位谷氨酸替换为缬氨酸，第75位苏氨酸替换为缬氨酸，第129位苏氨酸替换为丙氨酸，第142位甲硫氨酸替换为甘氨酸，第324位脯氨酸替换为亮氨酸；

18、h）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第75位苏氨酸替换为缬氨酸；

19、i）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第81位苯丙氨酸替换为甲硫氨酸；

20、j）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第81位苯丙氨酸替换为甲硫氨酸，第84位丙氨酸替换为亮氨酸，第129位苏氨酸替换为丙氨酸；

21、k）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第81位苯丙氨酸替换为甲硫氨酸，第84位丙氨酸替换为亮氨酸，第129位苏氨酸替换为丙氨酸，第324位脯氨酸替换为亮氨酸，第332位缬氨酸替换为半胱氨酸；

22、l）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第81位苯丙氨酸替换为甲硫氨酸，第129位苏氨酸替换为丙氨酸，第347位赖氨酸替换为苯丙氨酸；

23、m）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第129位苏氨酸替换为丙氨酸；

24、n）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第129位苏氨酸替换为丙氨酸，第142位甲硫氨酸替换为甘氨酸，第332位缬氨酸替换为半胱氨酸，第347位赖氨酸替换为苯丙氨酸；

25、o）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第142位甲硫氨酸替换为甘氨酸；

26、p）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第240位苏氨酸替换为天冬氨酸；

27、q）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第240位苏氨酸替换为天冬氨酸，第324位脯氨酸替换为亮氨酸，第332位缬氨酸替换为半胱氨酸；

28、r）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第324位脯氨酸替换为亮氨酸；

29、s）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第324位脯氨酸替换为亮氨酸，第332位缬氨酸替换为半胱氨酸；

30、t）将如seq id no.2所示氨基酸序列的第347位赖氨酸替换为苯丙氨酸。

31、进一步地，本发明是来源于枯草芽孢杆菌属(

bacillus subtilis)的糖基转移酶为母本，对其进行分子改造，得到所述糖基转移酶yojk的突变体，与母本相比，所述突变体均有活力提高，其中部分突变体的稳定性也有所提高。

32、本发明中的糖基转移酶突变体的获得方法为随机突变。

33、本发明所述糖基转移酶yojk突变体的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：将编码所糖基转移酶yojk并且带有点突变的核酸分子克隆到表达载体，将所得重组表达载体转化到表达宿主中，得到重组表达转化体；培养所得的重组表达转化体，分离纯化获得所述的糖基转移酶突变体。所述糖基转移酶突变体制备方法也可以通过人工合成蛋白质的氨基酸获得。

34、本发明的技术方案之二是：提供编码所述糖基转移酶yojk突变体的核酸。所述糖基转移酶突变体的编码核酸的来源包括：通过基因克隆技术获得所述糖基转移酶突变体的编码基因；或者通过人工全序列合成的方法获得所述糖基转移酶突变体的编码基因。

35、本发明的技术方案之三是：提供一种包含上述糖基转移酶突变体核酸的重组表达载体。所述的重组表达载体可通过本领域常规方法，将编码本发明所述的糖基转移酶突变体的核苷酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的糖基转移酶即可。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

36、优选地，对于大肠杆菌宿主，所述质粒载体优选为pet-28a(+)质粒。较佳的，可通过下述方法制得本发明所述的大肠杆菌重组表达质粒：将通过pcr扩增所得的糖基转移酶突变体的基因序列dna片段，用限制性内切酶

nde i和

xho i双酶切，同时将空载质粒pet-28a(+)同样用限制性内切酶

nde i和

xho i双酶切，回收上述酶切后的糖基转移酶突变体的dna片段以及空载质粒，利用t4 dna连接酶连接，构建获得用于大肠杆菌表达的含有本发明所述糖基转移酶突变体基因的重组表达载体。

37、本发明的技术方案之四是：提供一种包含本发明所述糖基转移酶突变体基因或其重组表达载体的重组表达转化体。

38、所述重组表达转化体可通过本领域常规技术，将上述重组表达载体转化至相应宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，更优选大肠杆菌

e.coli bl21(de3)用于高效表达本发明所述的糖基转移酶突变体。

39、本发明的技术方案之五是：提供一种重组糖基转移酶突变体催化剂，所述的重组糖基转移酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：

40、(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述糖基转移酶突变体的重组表达转化体细胞；

41、(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述糖基转移酶突变体的粗酶液；

42、(3)将所述糖基转移酶突变体的粗酶液冷冻干燥得到的冻干酶粉。

43、其中所述重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组糖基转移酶。

44、对于重组大肠杆菌，优选培养基为lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，ph 6.5～7.0。

45、优选的培养方法为：将如上所述的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的lb培养基中，37°c、180rpm振荡培养过夜。按1-2%(v/v)的接种量接入装有400ml的lb培养基(含卡那霉素)的2l三角烧瓶中，置于37°c、180rpm摇床振荡培养，当培养液的od600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，16-25°c诱导16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组表达转化体细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述糖基转移酶突变体的冻干细胞。将收获的重组表达转化体重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组糖基转移酶突变体的粗酶液。收集的粗酶液放置在-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到所述重组糖基转移酶突变体的冻干酶粉。将所获得的冻干细胞或者冻干酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。

46、本发明中所述糖基转移酶的活力测定方法：在含有10mm底物(莱鲍迪苷a)、1mmudpg的1ml体系(100mmol/l磷酸钾缓冲液，ph 8.0)中，加入适量的糖基转移酶进行测定。酶的活力单位(u)定义为在上述反应条件下，每分钟生成1μmol莱鲍迪苷d所需的酶量定义为1个酶活单位，即1u。

47、本发明的技术方案之六是：所述糖基转移酶突变体或重组糖基转移酶突变体催化剂在制备莱鲍迪苷d中的应用，所述的应用是将本发明所述的糖基转移酶加入到含有莱鲍迪苷a的溶液中，催化莱鲍迪苷a反应生成莱鲍迪苷d。

48、在前述应用中，莱鲍迪苷a浓度可为10～110mm，蔗糖用量为莱鲍迪苷a的4～10倍当量，所述重组糖基转移酶的用量可选为2～30g/l或0.5~100u/ml，蔗糖合酶atsus的用量可为4～20g/l，外加udp用量为0～2mm，缓冲溶液为ph 7.0～9.0的磷酸盐缓冲液。

49、其中当上述糖基转移酶突变体或重组糖基转移酶突变体催化剂为重组转化体细胞或冻干酶粉时，用量为2～30g/l，糖基转移酶突变体或重组糖基转移酶突变体催化剂为粗酶液时，用量为0.5~100u/ml。

50、所述蔗糖合酶来拟南芥

arabidopsis thaliana (genbank id:nm_122090.4，efficient enzymatic production of rebaudioside a from stevioside.

journal of

the agricultural chemical society of japan, 2016, 80(1), 67-73.)。

51、所述反应温度为20～55℃，优选30℃。所述的反应的时间以反应转化率停止增长的时间为准，优选反应时间小于24h。反应转化率采用液相色谱法进行分析，分析条件：c18柱(250mm×4.6mm)，流动相为乙腈：水=28:72(v/v)，柱温30°c，流速1.5ml/min，检测波长210nm。

52、其中莱鲍迪苷a的结构如式i所示：

53、

54、莱鲍迪苷d的结构如式ii所示：

55、

56、udp的结构式如式iii所示：

57、。

58、本发明的技术方案之七是：一种酶法级联转化制备莱鲍迪苷d的方法，以莱鲍迪苷a为底物，使用蔗糖合酶与本发明糖基转移酶突变体或重组糖基转移酶突变体催化剂进行酶法级联，顺序催化udp的糖基化、莱鲍迪苷a的糖基化，制得莱鲍迪苷d。

59、进一步地，包括以下步骤：

60、s1：udp存在下，蔗糖合酶催化蔗糖生成udp-葡萄糖；

61、s2：以步骤s1所得udp-葡萄糖为糖基供体，利用本发明的糖基转移酶突变体或重组糖基转移酶突变体催化剂催化莱鲍迪苷a发生糖基化制得莱鲍迪苷d，同时释放udp实现udp循环再生。

62、其中莱鲍迪苷a的结构如式i所示：

63、

64、莱鲍迪苷d的结构如式ii所示：

65、

66、udp的结构式如式iii所示：

67、。

68、进一步地，所述蔗糖合酶来拟南芥

arabidopsis thaliana (genbank id:nm_122090.4，efficient enzymatic production of rebaudioside a from stevioside.journal of the agricultural chemical society of japan, 2016, 80(1), 67-73.)

69、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

70、本发明提供了一种催化性能和热稳定性更好的糖基转移酶突变体，能够高效催化莱鲍迪苷a制备莱鲍迪苷d。所述糖基转移酶突变体能够催化103mm莱鲍迪苷a的反应，实现90%以上的转化率。相对于其他糖基转移酶，本发明得到的糖基转移酶突变体具有催化活性高，热稳定性更好，底物上载量大，产率高，生产成本低和环境友好等优势，具有很好的工业应用前景。