一种N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶的活性表达及应用

本发明涉及一种n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶的活性表达及应用，属于生物工程。

背景技术：

1、硫酸软骨素(chondroitin sulfate，cs)，是由葡萄糖醛酸(glucuronic acid，glca)和n-乙酰氨基半乳糖胺(n-acetylgalactosamine，galnac)通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接，并由磺基转移酶磺酸化修饰形成。根据不同的磺酸化修饰位点，分为不同的硫酸软骨素构型，主要分为csa、csc、cse和csd。cs是细胞外基质的重要组成部分，不同的组织部位含有的cs构型及含量也不同。不同结构的cs生物功能不同，例如csa和csc主要用于治疗骨关节炎，而cse主要用于刺激神经元生长。

2、目前，硫酸软骨素的商业化生产主要依赖于动物组织提取，例如猪、牛、鲨鱼的软骨组织等。然而，动物源硫酸软骨素的提前路线长而复杂，且提取的cs具有局限性，例如由于动物来源、年龄、提取部位不同导致每批次的产品质量不均一，因动物生长而产生冗长的周期性限制，动物组织提取过程中酸碱的使用而造成的环境污染以及存在潜在人畜交叉感染而导致的生物安全问题。基于动物提取的结构复杂性限制了硫酸软骨素的广泛应用，没有精确的结构，人们无法得到准确的药理结果。因此，越来越多的生物酶法合成单一的非动物源cs引起了广泛关注。

3、n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶(galnac 4-sulfate 6-o-sulfotransferase，galnac4s-6st)可以催化csa生成cse，是合成cse的关键酶。关于galnac4s-6st的微生物表达，目前已有文献报道galnac4s-6st在大肠杆菌中进行了活性表达，然而活性低，表达量低，且大肠杆菌不属于食品安全的微生物。因此，开发高活性表达galnac4s-6st的安全菌株对于cse的合成具有重要的意义，为扩展cs的应用范围奠定了基础。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶活性表达及其在硫酸软骨素e生物合成中的应用，本发明是以人来源的galnac4s-6st为出发序列，将n端氨基酸截短，并进行n端融合标签组合得到活性表达。

2、本发明提供了n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体，在seq id no.1所示出发序列的基础上，具有n端氨基酸截短，并对第152位、第163位、第170位、第189位、第200位、第365位、第380位或第471位的氨基酸突变。

3、在一种实施方式中，所述n端氨基酸截短是将n端分别截短1-102位、1-119位、1-122位、1-138位、1-151位、1-179位、1-190位氨基酸。

4、在一种实施方式中，所述突变包括如下一个或多个突变：

5、(1)将第152位的异亮氨酸突变为精氨酸；

6、(2)将第163位的异亮氨酸突变为天冬氨酸；

7、(3)将第170位的亮氨酸突变为谷氨酸；

8、(4)将第189位的天冬酰胺突变为酪氨酸；

9、(5)将第200位的色氨酸突变为苯丙氨酸；

10、(6)将第365位的丝氨酸突变为脯氨酸；

11、(7)将第380位的丙氨酸突变为苏氨酸；

12、(8)将第471位的谷氨酰胺突变位酪氨酸。

13、在一种实施方式中，所述n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体是在seq id no.1所示出发序列的基础上，截短n端1-122位氨基酸，并融合选自如下的融合标签：sumo、trxa、mbp、gst或nusa。

14、在一种实施方式中，所述n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体是在seq id no.1所示出发序列的基础上，截短第1～122个氨基酸，并融合sumo标签，并将第170位的亮氨酸突变为谷氨酸，并将第200位的色氨酸突变为苯丙氨酸，并将第365位的丝氨酸突变为脯氨酸。

15、本发明还提供了编码所述n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体的基因。

16、本发明还提供了含有所述基因的重组质粒。

17、在一种实施方式中，所述载体以质粒ppic9k为骨架。

18、本发明还提供了表达所述n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体的微生物细胞。

19、在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于解脂耶氏酵母、酿酒酵母、毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母。

20、本发明还提供了制备硫酸软骨素e的方法，以硫酸软骨素a为底物，应用所述n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体催化制备硫酸软骨素e。

21、在一种实施方式中，所述应用是以硫酸软骨素a为底物，以所述n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶为催化剂，在pnps、paps和ast iv的参与下制备硫酸软骨素e。

22、在一种实施方式中，所述应用是在35～40℃反应至少2h。

23、本发明还提供了所述n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体或所述方法在制备含硫酸软骨素e或硫酸皮肤素的产品中的应用。

24、有益效果：

25、本发明通过对n端氨基酸序列截短，使截短1-122位氨基酸的截短体酶活达到99.4u/l，进一步通过在n端融合sumo标签，并引入突变构建的三突变体l170e/w200f/s365p酶活可达到740.0u/l。

26、本发明还提供了所述n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶在制备并成功合成cse。本发明galnac4s-6st成功活性表达，为合成非动物来源的cse奠定了基础，开拓了cs的应用市场。

1.n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体，其特征在于，在seq id no.1所示出发序列的基础上，具有n端氨基酸截短，并对第152位、第163位、第170位、第189位、第200位、第365位、第380位或第471位的氨基酸突变。

2.根据权利要求1所述的n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体，其特征在于，所述n端氨基酸截短是将n端分别截短1-102位、1-119位、1-122位、1-138位、1-151位、1-179位、1-190位氨基酸。

3.根据权利要求1或2所述的n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体，其特征在于，所述突变包括如下一个或多个突变：

4.根据权利要求1所述的n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体，其特征在于，截短n端1-122位氨基酸，并融合选自如下的融合标签：sumo、trxa、mbp、gst或nusa。

5.编码权利要求1～4任一所述n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体的基因。

6.含有权利要求5所述基因的重组质粒。

7.表达权利要求1～5任一所述n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体的微生物细胞。

8.一种制备硫酸软骨素e的方法，其特征在于，以硫酸软骨素a为底物，以所述n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶为催化剂，在pnps、paps和ast iv的参与下制备硫酸软骨素e。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在35～40℃反应至少2h。

10.权利要求1～4任一所述的n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐-6-磺基转移酶突变体在催化硫酸软骨素a转化为硫酸软骨素e方面的应用。