一种竹节参糖基转移酶及其在生产伪人参皂苷中的应用

本发明属于生物，具体涉及一种竹节参糖基转移酶及其在生产伪人参皂苷（rt1或rp1）中的应用。

背景技术：

1、伪人参皂苷rt1是一种稀有的齐墩果烷型人参皂苷，具有抗高血压和抗癌等多种药理活性，在药用植物研究领域备受关注。然而，伪人参皂苷rt1在人参属植物中的天然含量极低，严重限制了其大规模获取和应用。目前，伪人参皂苷rt1的获取主要依赖于从植物材料中提取分离，但这种方法存在效率低下、成本高昂、资源消耗大等问题。

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3、随着生物技术的发展，利用糖基转移酶(ugt)催化合成人参皂苷的方法逐渐成为研究热点。糖基转移酶是一类能够催化糖基从活化的糖基供体转移到受体分子上的酶，在植物次生代谢物的生物合成中发挥着关键作用。近年来，多种来源的糖基转移酶被发现并应用于人参皂苷的生物合成。

4、例如，cn114107255a公开了一种从竹节参中挖掘得到的新型糖基转移酶基因，该糖基转移酶能够将奥克梯隆型人参皂苷苷元转化为拟人参皂苷rt5，并通过设计多个突变体显著提升了反应底物的葡萄糖基修饰效率。cn110343678a公开了一种珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因，该基因编码的糖基转移酶能够以竹节参皂苷iva和udp-葡萄糖为原料，在竹节参皂苷iva的c3位上的葡萄糖醛酸基团上进行糖基化，生成人参皂苷ro。

5、此外，cn119120409a公开了一种珠子参糖基转移酶pjvmugt45及其突变体，该蛋白能够以人参皂苷ck和ppd为底物催化生成稀有人参皂苷f2和rh2，且其催化效率显著优于人参属中已知的两个具有同样催化功能的糖基转移酶。cn111235124a则公开了一种珠子参糖基转移酶ugtpjm2，该酶能够在植物体外催化齐墩果酸-3-o-β-葡萄糖醛酸苷的c-28位的羧基糖基化，进而生成竹节参皂苷iva。cn115109787a公开了在三七基因组中挖掘得到的3个糖基转移酶新基因，为人工合成人参/三七皂苷单体提供了新的基因资源。

6、尽管已有多种糖基转移酶被发现并应用于人参皂苷的生物合成，但目前尚未有专门针对伪人参皂苷rt1生物合成的糖基转移酶被报道。现有技术中缺乏能够直接催化竹节参皂苷iva和udp-木糖产生伪人参皂苷rt1的特异性糖基转移酶。此外，现有的人参皂苷生物合成方法往往存在酶活性低、底物特异性差、反应条件苛刻等问题，难以实现伪人参皂苷rt1的高效生产。

7、因此，亟须开发一种能够高效催化合成伪人参皂苷rt1的特异性糖基转移酶，并建立基于该酶的生物转化体系，以实现伪人参皂苷rt1的高效、绿色生产，满足医药研究和临床应用的需求。

技术实现思路

1、为了解决伪人参皂苷rt1天然含量低、传统提取方法效率低下且不环保、分离纯化困难等技术问题，实现伪人参皂苷rt1的高效绿色生产，本发明提供了一种竹节参糖基转移酶pjugt67及其在生产伪人参皂苷中的应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、第一方面，本发明请求保护一种蛋白质，该蛋白为竹节参糖基转移酶pjugt67，具体为如下(1)~(4)中任一项所述的蛋白质：

4、(1) 具有如seq id no:2所示氨基酸序列的蛋白质；

5、(2) 在seq id no:2所示氨基酸序列的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；

6、(3) 将seq id no:2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

7、(4) 与seq id no:2所示氨基酸序列具有至少75%同源性且具有相同功能的蛋白质。

8、第二方面，本发明请求保护编码上述蛋白质的基因。

9、进一步，所述基因为如下(1)~(3)中任一项所述的dna分子：

10、(1) 具有如seq id no:1所示核苷酸序列的dna分子；

11、(2) 与seq id no:1所示核苷酸序列互补的dna分子；

12、(3) 与seq id no:1所示核苷酸序列具有至少75%同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。

13、第三方面，本发明请求保护含有上述基因的生物材料，所述的生物材料为重组载体、表达盒、宿主细胞或重组菌。

14、进一步，所述的重组载体为将上述基因插入表达载体，得到表达所述蛋白质的重组表达载体；优选的，所述重组表达载体为将seq id no:1所示核苷酸序列插入大肠杆菌载体pcold tf的bamhi和sali识别位点间得到的重组表达载体。

15、第四方面，本发明请求保护上述蛋白质作为udp-木糖转移酶在如下(1)~(2)中的至少一种应用：

16、(1) 以竹节参皂苷iva和udp-木糖为底物，催化生产伪人参皂苷rt1；

17、(2) 以金盏花苷e和udp-木糖为底物，催化生产伪人参皂苷rp1。

18、第五方面，本发明请求保护上述基因、或上述生物材料如下(1)~(2)中的至少一种应用：

19、(1) 以竹节参皂苷iva和udp-木糖为底物，催化生产伪人参皂苷rt1；

20、(2) 以金盏花苷e和udp-木糖为底物，催化生产伪人参皂苷rp1。

21、第六方面，本发明请求保护一种生产上述蛋白质（糖基转移酶）的方法，对上述生物材料中的重组菌进行发酵培养，从发酵产物中分离纯化获得所述蛋白质。

22、第七方面，本发明请求保护一种生物转化生产伪人参皂苷rt1和/或伪人参皂苷rp1的方法，以所述蛋白质作为糖基转移酶，或以所述生物材料中的重组菌的发酵产物作为糖基转移酶，进行如下(1)~(2)中的至少一种反应：

23、(1) 以竹节参皂苷iva和udp-木糖为底物，反应生产伪人参皂苷rt1；

24、(2) 以金盏花苷e和udp-木糖为底物，反应生产伪人参皂苷rp1。

25、进一步，所述反应的条件为：在温度25℃~40℃、ph 5.0~10.0的缓冲液中进行。优选的，所述反应的条件为：在温度35℃、ph 7.0的缓冲液中进行，所述的缓冲液为pbs缓冲液。

26、本发明技术方案中，以上述的重组菌进行发酵获得的菌体破碎上清液或纯化蛋白作为糖基转移酶催化剂进行反应的过程，具体包括如下步骤：

27、(1)发酵所述的重组菌，培养后收集发酵液，离心收集菌体，破碎菌体后离心收集上清液，得到含糖基转移酶的粗酶液；可选地，将粗酶液纯化，得到纯化蛋白；

28、(2)将所述粗酶液或纯化蛋白与竹节参皂苷iva（或含有竹节参皂苷iva的粗提物）、udp-木糖在35℃、ph 7.0的pbs缓冲液中反应，经萃取或分离纯化得到伪人参皂苷rt1。

29、(3)将所述粗酶液或纯化蛋白与金盏花苷e（或含有金盏花苷e的粗提物）、udp-木糖在35℃、ph 7.0的pbs缓冲液中反应，经萃取或分离纯化得到伪人参皂苷rp1。

30、所述的发酵为在iptg诱导下进行或不诱导直接发酵。

31、以竹节参皂苷iva和udp-木糖为底物，反应生产伪人参皂苷rt1的反应方程式如下所示：

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33、以金盏花苷e和udp-木糖为底物，反应生产伪人参皂苷rp1的反应方程式如下所示：

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35、本发明的实验证明，本发明的竹节参糖基转移酶pjugt67具有高效转化竹节参皂苷iva生成伪人参皂苷rt1的作用。

36、本发明的实验同时证明，本发明的竹节参糖基转移酶pjugt67还具有高效转化金盏花苷e生成伪人参皂苷rp1的作用。

37、本发明的有益效果在于：

38、本发明首次从竹节参中克隆得到了参与伪人参皂苷rt1生物合成的关键糖基转移酶基因，该酶能够高效催化竹节参皂苷iva和udp-木糖生成伪人参皂苷rt1，同时还能催化金盏花苷e和udp-木糖生成伪人参皂苷rp1。与传统的有机溶剂提取法相比，本发明提供的生物酶催化技术具有以下显著优势：

39、(1)催化效率高，能够在温和条件下（35 ℃，ph 7.0）高效进行糖基转移反应；

40、(2)反应条件温和，无需使用有机溶剂，符合绿色化学原则；

41、(3)底物特异性强，可直接获得高纯度目标产物，简化了后续分离纯化步骤；

42、(4)易于规模化生产，可通过发酵工程技术大量获取酶蛋白，实现伪人参皂苷rt1的工业化生产。

43、本发明契合"源头控制"型绿色制造理念，为伪人参皂苷rt1等稀有人参皂苷的高效绿色生产提供了新途径，具有重要的应用价值和产业化前景。