一种牛流行性热病毒的亚单位G蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明属于动物疫苗与兽用生物制品，特别涉及牛流行性热病毒的亚单位g蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1、牛流行性热(bovine ephemeral fever，bef)是由牛流行性热病毒(bovineephemeral fever virus，befv)引起的一种急性、热性传染性疾病。该病病程短，传播力强，速度快，发病率高，临床上又称暂时热或三日热，可导致牛高热、瘫痪和跛行等，奶牛感染使产奶量大幅度下降，怀孕母牛感染科致流产、死胎等。该病全球流行，给养牛业带来巨大的经济负担和生产损失，严重影响养牛业的发展。

2、目前对该病尚无有效的治疗手段，主要依靠疫苗进行防控。国内尚无疫苗上市，临床上多通过给牛注射感染期病牛的血液来保护牛群。该方法虽然取得了一定的效果，但有引入新的病原的风险。为了控制牛流行性热病毒的感染，需要开发新的安全有效的新型疫苗。

3、befv病毒属弹状病毒科成员，病毒粒子呈圆锥形或子弹状，长约100～430nm，宽约45～100nm，病毒粒子表面覆盖有囊膜，囊膜表面有纤突，纤突的直径为10～12nm。befv基因组编码6个主要结构蛋白：核衣壳蛋白(n)、磷蛋白(p)、基质蛋白1(m1)、基质蛋白2(m2)、糖蛋白(g)、gns、聚和酶蛋白(l)蛋白等。其中g蛋白是病毒囊膜的主要蛋白，能够刺激机体产生中和抗体，是亚单位疫苗的首选糖蛋白。g蛋白亚单位疫苗不含有核酸物质，接种后不会产生持续感染或潜伏感染；产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。但是g蛋白亚单位疫苗也有明显的缺陷：表达产量比较低，生产成本高，应用受到限制。

4、亚单位疫苗的成本主要在亚单位蛋白的生产上，g蛋白是牛流行性热病毒进入细胞所必需的囊膜糖基化修饰三聚体蛋白。一般由623个氨基酸组成，其表面含有5个糖基化位点，糖类成份占10％，糖基化对蛋白质的空间构象起着重要的作用，决定这抗原决定簇的形成。因此，为了保证表达蛋白能够有糖基化修饰和形成完整活性的g蛋白，必须在动物细胞中才能实现。

5、工程化细胞是目前生物制药工程上广泛使用的表达细胞。在该系统表达的蛋白在分子结构、理化特性和转录后修饰等生物学功能方面最接近于天然蛋白分子。且能以悬浮培养方式达到高密度培养，且培养体积能达到2,000l以上，可以大规模生产。

6、研究表明，在使用工程化细胞表达g蛋白时，g蛋白的编码基因序列未经改造优化时，工程化细胞基本表达g蛋白量低，即使去掉跨膜区和胞内区，蛋白产量也不高，难以获得具有优良免疫原性和稳定性的g蛋白以供牛流行性热病毒的防控，因此，在使用工程化细胞表达g蛋白时，对g蛋白的编码基因序列进行优化和设计是一个必须的过程。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种牛流行性热病毒的亚单位g蛋白，其亚单位g蛋白在原有g蛋白基础上，具有牛流行性热病毒g蛋白优良的免疫原性和稳定性，同时便于在cho细胞株中稳定高效的分泌表达。

2、本发明的第二个目的在于提供一种牛流行性热病毒的亚单位g蛋白的制备方法，便于亚单位g蛋白的大规模工业化生产，降低了g蛋白的生产成本。

3、本发明的第三个目的在于提供一种牛流行性热病毒的亚单位g蛋白的应用，能够较好的应用于牛流行性热病毒的亚单位疫苗和诊断试剂中，从而便于人们对牛流行性热病毒的防控。

4、为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种牛流行性热病毒的亚单位g蛋白，所述亚单位g蛋白的氨基酸序列：

5、1)如seq id no.2所示的氨基酸序列；

6、2)由seq id no.2经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有免疫原性的衍生的氨基酸序列。

7、根据本发明的牛流行性热病毒的亚单位g蛋白，优选地，在如seq id no.2所示的氨基酸序列的羧基末端还连接有一三聚体基序gcn4蛋白，所述三聚体基序gcn4蛋白的氨基酸序列如seq id no.10所示，得到亚单位g蛋白与三聚体基序gcn4蛋白的融合蛋白i，所述融合蛋白i的氨基酸序列如seq id no.3所示。

8、根据本发明的牛流行性热病毒的亚单位g蛋白，优选地，在所述融合蛋白i的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-his、flag、c-myc、ha、poly-arg中的一种标签。

9、根据本发明的牛流行性热病毒的亚单位g蛋白，优选地，所述标签为poly-his，得到牛流行性热病毒的亚单位g蛋白，其氨基酸序列如seq id no.4所示。

10、根据本发明的牛流行性热病毒的亚单位g蛋白，优选地，所述亚单位g蛋白的编码基因序列如seq id no.8所示，在seq id no.8所示的亚单位g蛋白的编码基因序列的基础上进行密码子优化，得到如seq id no.9所示的序列。

11、为了实现上述第二个目的，本发明提供了一种牛流行性热病毒的亚单位g蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

12、1)构建牛流行性热病毒的亚单位g蛋白的编码基因序列如seq id no.9所示；

13、2)将步骤1)构建的所述亚单位g蛋白的编码基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有所述亚单位g蛋白编码基因序列的重组质粒；

14、3)将步骤2)得到的含有所述亚单位g蛋白编码基因序列的重组质粒转染至动物的工程化细胞中，得到细胞株；

15、4)从步骤3)得到的所述细胞株中筛选出高度表达的细胞株；以及

16、5)发酵培养步骤4)中得到的所述高度表达的细胞株，纯化后得到牛流行性热病毒的亚单位g蛋白。

17、在本发明的制备方法中，优选地，步骤2)中，所述真核表达载体为pee6.4、pee12.4、pgl4.13和pcdna3.1中的一种。

18、在本发明的制备方法中，优选地，步骤2)中，所述真核表达载体为pee12.4。

19、在本发明的制备方法中，优选地，步骤3)中，所述细胞株为cho细胞株、hek293细胞株、293t/17细胞株中的一种。

20、在本发明的制备方法中，优选地，步骤3)中，所述cho细胞株为dg44细胞株、dxb11细胞株、cho-k1细胞株和cho-s细胞株中的一种。

21、为了实现上述第三个目的，本发明提供了一种牛流行性热病毒的亚单位g蛋白在用于牛流行性热病毒的亚单位疫苗或诊断试剂中的应用。

22、本发明提供了第一种亚单位g蛋白，具有牛流行性热病毒g蛋白优良的免疫原性和稳定性，同时便于在工程化细胞株中稳定高效的分泌表达，其产量高且易于纯化，在细胞培养上清中的目的蛋白纯度都能达到70％以上，只需一步亲和层析就能使目的蛋白纯度达到90％以上，远远满足亚单位疫苗和诊断试剂的需求，同时便于大规模生产，由此，解决了牛流行性热病毒的亚单位g蛋白生产成本高的技术问题。另外，由于生产用的cho细胞株、hek293细胞株、293t/17细胞株等工程化细胞株在培养时可控制性高、质控容易、生产蛋白批次间稳定，因此本发明生产的牛流行性热病毒的亚单位g蛋白中其他病毒量少，有效降低了散毒的风险，具有优异的生物安全性。