人多发性骨髓瘤休眠样细胞株RPMI8226-DT及其构建方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi8226-dt及其构建方法和应用。

背景技术：

1、多发性骨髓瘤是一种以骨髓内克隆性浆细胞异常增殖为主要特征的血液系统恶性肿瘤。随着蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、抗cd38单克隆抗体、双特异性抗体以及嵌合抗原受体t细胞治疗等方案的发展，多发性骨髓瘤患者的缓解深度和生存时间已显著改善。然而，多发性骨髓瘤仍然具有反复复发和难以根治的特点，治疗后残留肿瘤细胞的长期存留以及再次扩增仍是疾病复发的重要原因。

2、残留骨髓瘤细胞可在骨髓微环境中获得生存支持，并表现出低增殖、治疗耐受和再激活潜能等特征。现有研究提示，骨髓生态位参与骨髓瘤细胞休眠维持和再激活过程，休眠样骨髓瘤细胞可能在特定微环境中逃避免疫清除和药物杀伤，并在条件改变后重新进入增殖状态，从而参与疾病复发。由于这类细胞数量少、状态动态变化，如何在体外或体内实验系统中构建可重复、可用于药物评价的休眠样骨髓瘤细胞模型，仍是多发性骨髓瘤复发机制研究和药物研发中的重要技术问题。

3、目前，多发性骨髓瘤研究中常用的细胞模型多为连续传代培养的增殖型细胞系，适合研究肿瘤细胞增殖、信号通路和常规药物敏感性，但难以充分模拟残留骨髓瘤细胞在骨髓生态位中的低增殖、休眠样存留、治疗耐受和再生长状态。另一方面，已有耐药模型通常通过长期药物暴露、药物浓度递增或间歇性药物冲击等方式构建，主要用于研究特定药物压力下获得性耐药的形成机制。该类模型虽然对耐药研究具有价值，但其构建周期较长，构建过程依赖外源药物压力，且难以充分反映骨髓生态位相关残留骨髓瘤细胞的低增殖存留状态和休眠样生物学特征。

技术实现思路

1、为克服现有多发性骨髓瘤细胞模型存在的多处于持续增殖状态、难以模拟休眠样残留细胞状态以及现有耐药模型通常依赖长期药物诱导、构建周期长且难以充分反映骨髓生态位相关低增殖存留状态的问题，本发明提供一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi8226-dt及其构建方法和应用。

2、本发明采用基因编辑手段、休眠相关功能表型评价以及药物敏感性评价相结合的方式构建了一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt，该人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt具有来源明确、表型稳定、可重复传代的优点，并能够应用于多发性骨髓瘤休眠机制、骨髓生态位相关存留机制、复发相关残留骨髓瘤细胞机制以及低增殖存留状态等研究工作中，同时还可应用于评价蛋白酶体抑制剂耐受相关表型和筛选增敏策略，可为研究骨髓瘤细胞低增殖存留、骨髓生态位相关休眠样状态、治疗耐受相关表型以及筛选清除休眠样细胞和恢复药物敏感性的候选药物提供实验基础。

3、本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

4、本发明的第一个目的是提供一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt。

5、本发明提供的一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt，已于2026年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2026110。

6、作为一种优选的实施例，所述人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt由多发性骨髓瘤细胞rpmi 8226经靶向plp2基因的sgrna/cas9系统敲除获得。

7、作为一种优选的实施例，所述人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt具有plp2蛋白表达缺失特征。

8、本发明的第二个目的是提供一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt的构建方法。

9、本发明提供的一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt的构建方法，具体包括以下步骤：

10、将靶向plp2基因的sgrna/cas9系统通过慢病毒导入多发性骨髓瘤细胞rpmi8226，筛选获得plp2敲除细胞；对plp2敲除细胞进行plp2表达验证和细胞核形态检测；当plp2敲除细胞与亲代多发性骨髓瘤细胞rpmi 8226或阴性对照细胞相比，表现为plp2蛋白表达缺失时，获得所述人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt。

11、作为一种优选的实施例，所述sgrna对应的dna靶序列包括plp2-sgrna1靶序列和plp2-sgrna2靶序列；所述plp2-sgrna1靶序列为5′-accaggctactcctccctgt-3′；所述plp2-sgrna2靶序列为5′-ccagttgatgaatggtatct-3′。

12、作为一种优选的实施例，所述慢病毒由含靶向plp2基因的sgrna/cas9表达载体、病毒包装质粒pspax2和病毒包膜质粒pmd2.g共同转染hek293t细胞获得。

13、作为一种优选的实施例，所述靶向plp2基因的sgrna/cas9表达载体为lenticrispr-sgrna-plp2重组载体，通过将dna靶序列构建至lenticrispr v2质粒中获得。

14、作为一种优选的实施例，所述共同转染的流程为：将lenticrispr-sgrna-plp2重组载体、病毒包装质粒pspax2和病毒包膜质粒pmd2.g混合，采用lipofectamine 3000转染试剂进行转染；转染后收集含靶向plp2的sgrna/cas9慢病毒上清，经过滤后转导多发性骨髓瘤细胞rpmi 8226，采用嘌呤霉素进行筛选，获得稳定plp2敲除细胞。

15、作为一种优选的实施例，所述lenticrispr-sgrna-plp2重组载体、病毒包装质粒pspax2和病毒包膜质粒pmd2.g的质量比为(2-4):(1-3):1。

16、本发明的第三个目的是提供一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt的应用。

17、作为一种优选的实施例，本发明提供的一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi8226-dt能够应用于构建多发性骨髓瘤休眠样细胞模型。

18、作为一种优选的实施例，本发明提供的一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi8226-dt能够应用于多发性骨髓瘤休眠机制、骨髓生态位相关存留机制、复发相关残留骨髓瘤细胞机制和低增殖存留状态研究。

19、作为一种优选的实施例，本发明提供的一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi8226-dt能够应用于筛选清除、逆转、调控多发性骨髓瘤休眠样细胞的候选药物、组合物及其联合用药方案。

20、作为一种优选的实施例，本发明提供的一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi8226-dt能够应用于评价蛋白酶体抑制剂耐受相关表型。

21、作为一种优选的实施例，本发明提供的一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi8226-dt能够应用于筛选恢复、增强硼替佐米敏感性的候选药物、组合物及其联合用药方案。

22、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

23、第一，本发明提供了一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt，该细胞株来源明确，具有表型可观察、可传代保存、便于药物筛选等优点。

24、第二，本发明提供的一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi 8226-dt，可用于三维基质胶培养、鸡胚绒毛尿囊膜模型和骨髓腔内异种移植模型，以研究多发性骨髓瘤休眠样细胞在三维环境、胚胎血管环境以及骨髓生态位相关条件下的休眠样行为、细胞存留、低增殖状态以及再生长能力。

25、第三，cck-8药敏实验显示，本发明提供的一种人多发性骨髓瘤休眠样细胞株rpmi8226-dt较亲代多发性骨髓瘤细胞rpmi 8226表现出降低的硼替佐米敏感性，可应用于评价蛋白酶体抑制剂耐受相关表型，并应用于筛选恢复、增强硼替佐米敏感性的候选药物、组合物及其联合用药方案，具有药物研发和机制研究应用价值。

26、第四，本发明还提供rpmi 8226-dt细胞株经传代培养获得的子代细胞，子代细胞保持plp2蛋白表达缺失的特征。