一种跨血脑屏障诱导双重靶向蛋白降解的工程化Fc融合蛋白及应用

本发明属于大分子药物领域，具体地，涉及一种诱导双重靶向蛋白降解的工程化fc融合蛋白，以及该融合蛋白在胶质母细胞瘤治疗中的应用。

背景技术：

1、胶质母细胞瘤（glioblastoma，gbm）是脑肿瘤中恶性程度最高，难以治愈的一种原发性肿瘤。由于gbm具有高度的浸润性和遗传异质性，手术切除困难，且放化疗及免疫治疗均对其作用有限，并发症风险高，患者预后极差，治疗难度大。开发gbm治疗的新靶点及新策略因此具有重要的科学意义和临床价值。

2、近年来，越来越多的研究表明，神经系统在肿瘤的发生发展和侵袭转移过程中发挥着关键作用。近期的研究指出，胶质瘤-神经元的相互作用是胶质瘤进展的基础，该互作是治疗胶质瘤的一个潜在靶向目标。2023年，nature cancer报道了gbm的治疗新靶点，其是一个由eag2–kvβ2复合物形成的钾离子通道。该研究表明，eag2和kvβ2两种蛋白在胶质母细胞瘤中高表达，并在肿瘤细胞与正常组织的交界处形成钾离子通道，调控胶质瘤-神经元相互作用，与胶质瘤的生长、侵袭以及化疗耐药息息相关。基于此，该研究团队设计了一段具有透膜性的多肽（k90-114tat）以破坏两个蛋白质之间的相互作用，该多肽药物对gbm显示出了较为显著的抑瘤效果，即使对替莫唑胺耐药的gbm也有抑制作用，且无明显的毒副作用。然而，由于多肽难以跨过血脑屏障（blood brain barrier，bbb），该药物只能通过在体内植入渗透泵配合套管进行脑室给药，体内应用受到极大限制，亟待开发有效的递送策略以促进其的临床应用。

3、靶向蛋白降解技术（targeted protein degradation，tpd）是近年来药物研发领域新兴的一类技术，该技术通过功能分子（蛋白降解剂）利用细胞内天然存在的蛋白降解系统降解疾病相关蛋白，从而达到治疗疾病的目的。此类技术直接高效诱导靶蛋白降解，采用有别于传统小分子药物抑制蛋白功能的作用方式，从而使目前很多“难以成药”的靶点具备“成药性”，能够靶向传统小分子抑制剂难以靶向的靶点，例如蛋白-蛋白相互作用等。通过设计蛋白降解剂同时结合e3泛素连接酶和靶蛋白，利用细胞内的泛素-蛋白酶体系统ups降解胞内疾病相关蛋白是靶向蛋白降解技术中发展最为迅速，具有较好应用前景的一类。

技术实现思路

1、本发明的目的是构建eag2-kvβ2复合物靶向多肽与工程化fc段的融合蛋白，利用工程化fc段解决eag2-kvβ2复合物靶向多肽的脑内递送问题，同时，引入靶向蛋白降解技术，将eag2-kvβ2复合物靶向多肽与工程化fc段的融合蛋白开发成降解剂，利用可识别抗体fc段的e3泛素连接酶介导的蛋白酶体降解以降解eag2，从而彻底破坏eag2-kvβ2离子通道的功能发挥，增强抗肿瘤作用。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种诱导双重靶向蛋白降解的工程化fc融合蛋白，依次包括细胞穿膜肽、连接体、eag2结合肽、工程化的igg的fc段和脑胶质瘤靶向肽，所述工程化的igg的fc段的序列如seq id no：1和seq id no：2所示。

3、fc融合蛋白中的工程化fc段，是经工程化改造的igg的fc段，其可特异性结合大脑内皮细胞高表达的人源转铁蛋白受体，借助受体介导的转运作用将其所携载的大分子跨越bbb，实现脑内递送。此外，工程化改造fc片段所突变的氨基酸位点，既在序列上不与trim21结合关键位点重合，又在空间上远离结合的关键位点，因此并不影响fc片段与trim21的结合。

4、fc融合蛋白中的脑胶质瘤靶向肽是一段肿瘤归巢肽，用于靶向胶质瘤细胞，根据本发明一种优选实施方式，所述脑胶质瘤靶向肽的序列如seq id no：3所示，其可靶向结合grp78蛋白。据报道，grp78在胶质瘤细胞、血管内皮细胞和胶质瘤干细胞中都高表达，且在正常细胞中几乎无表达，是用于胶质瘤药物递送的优良靶点。

5、根据本发明一种优选实施方式，所述eag2结合肽的序列如seq id no：4所示，eag2结合肽为前文所述eag2–kvβ2复合物靶向多肽--- k90-114tat除穿膜肽部分，可与eag2结合。

6、根据本发明一种优选实施方式，所述细胞穿膜肽的序列如seq id no：5所示，该细胞穿膜肽源自1型人免疫缺陷病毒转录激活因子tat（human immunodeficiency virus-1transcription activator, hiv-1 tat）。

7、连接体的作用是有效间隔细胞穿膜肽和eag2结合肽以保证二者功能的正常发挥，本发明的发明人经摸索优化，确定了如seq id no：6所示序列的连接体。

8、本发明中，由于工程化的igg的fc段包括两条链，所形成的融合蛋白也相应地包括两条肽链，各功能单元所处的位置能够保证满足各自功能即可，根据本发明一种优选实施方式，两条肽链中的一条自n端至c端依次为细胞穿膜肽、连接体、eag2结合肽和工程化的igg的fc段的一条链，另一条自n端至c端依次为脑胶质瘤靶向肽和工程化的igg的fc段的另一条链。

9、本发明的工程化fc融合蛋白可通过融合表达获得，在序列已知的前提下，本领域技术人员可以通过本领域常规的方法获得目标蛋白。

10、本发明所设计的多功能工程化fc融合蛋白降解剂诱导肿瘤细胞死亡的原理如图1所示：当该fc融合蛋白进入循环系统后，其首先借助工程化fc段与人源转铁蛋白受体htfr结合，在htfr介导的转运作用跨过bbb，进而通过靶向肽靶向胶质瘤细胞在肿瘤处富集，之后借助细胞穿膜肽有效跨膜入胞。在胞质内，fc融合蛋白中通过fc段与脑胶质细胞高表达的trim21结合，同时通过eag2结合肽部分与靶蛋白eag2结合，由此形成一个“trim21-fc融合蛋白-eag2”三元复合物；此时，fc段与trim21的结合激活了trim21的活性，引发其发生自泛素化，促使三元复合物被蛋白酶体识别并降解。trim21和eag2的双降解形成对胶质母细胞瘤的双靶作用，最终诱导肿瘤细胞死亡。

11、因此本发明的诱导双重靶向蛋白降解的工程化fc融合蛋白可用于制备治疗胶质母细胞瘤的药物。

12、本发明的技术效果在于：

13、（1）巧妙发掘抗体fc段的多种功能，既通过对fc段的工程化，解决了目前多肽/蛋白类药物难以跨过bbb所带来的应用困境，又抓住fc段是trim21与抗体降解剂作用的核心，开发出具备跨bbb功能，同时兼具细胞靶向性和透膜性的双重靶向蛋白降解剂---多动能工程化fc融合蛋白，使降解剂呈现功能和类型的多样化，进而拓宽原有靶向蛋白降解技术的应用范围，同时发展了治疗gbm的新策略。

14、（2）利用trim21和eag2与胶质母细胞瘤的特异相关性，通过单一分子（多功能工程化fc融合蛋白降解剂）调控trim21的自身泛素化及其介导的对自身和靶蛋白的双降解，以形成对trim21和eag2均高表达的胶质母细胞瘤细胞的双靶作用，增强了抗肿瘤的效果。

15、本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。