用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体

本发明属于生物，具体涉及一种用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体。

背景技术：

1、中枢神经系统疾病，如阿尔茨海默病（ad）、帕金森病（pd）、肌萎缩侧索硬化症（als）、多发性硬化症（ms）以及一些神经炎症性疾病等，其发病机制复杂，目前缺乏有效的治愈手段。近年来，越来越多的研究表明，肠道与大脑之间存在密切的双向通讯网络，即“肠-脑轴”（gut-brain axis）。

2、肠上皮细胞作为“肠-脑轴”中肠道黏膜屏障的主要部分，负责营养吸收、抵御病原体入侵和维持肠道内环境稳定。当肠上皮细胞因遗传突变、炎症、感染、毒素暴露、菌群失调或应激等因素受损时，可能会产生或释放“异常蛋白”。肠道上皮屏障功能障碍导致的“异常蛋白”进入血液循环，可能通过多种途径影响中枢神经系统健康。而目前针对中枢神经系统疾病的临床治疗药物多仅能缓解症状，无法阻止疾病进展。因此，通过肠道途径干预中枢神经系统疾病成为一种新兴策略。

3、其中，利用口服活菌在肠道定植并持续分泌治疗性工程化外泌体清除肠上皮细胞内累计的异常蛋白，为阿尔茨海默病、帕金森病等疾病的长期、微创管理提供了极具前景的全新治疗范式。然而，该策略的成功实施，完全依赖于能否将活的工程菌及其产生的外泌体安全、精准、高效地递送至肠道靶定位点并实现稳定定植。现有口服递送技术在此关键环节存在一系列根本性缺陷，严重制约了该疗法的转化与应用。

4、首先，在胃酸屏障抵抗方面，现有肠溶包衣的ph依赖性溶解行为与复杂的胃肠生理环境匹配不佳。胃排空时间与十二指肠酸度的个体差异，常导致包衣在胃内或十二指肠近端过早崩解，使对酸极度敏感的活菌暴露于强酸环境而迅速失活，造成活菌及分泌的工程化外泌体递送至肠上皮细胞的量远低于有效定植的阈值。其次，现有技术无法实现肠道内释放的时空精准控制，活菌在不同肠段的定植效率差异显著，理想的释放位点常位于回肠末端或结肠。传统肠溶制剂缺乏对肠道蠕动、菌群微环境及特定生物标志物的智能响应能力，往往在非目标肠段过早释放，导致菌暴露于不利的氧气环境或竞争性极强的原生菌群中，难以有效定植。更为关键的是，现有制剂在活菌递送后即视为任务终结，完全缺乏对其定植初期这一关键阶段的持续支持，新递送的菌面临宿主免疫防御、原生菌群竞争及肠液冲刷等多重压力导致难以有效释放工程化外泌体。当前技术所用的载体材料无法在递送后提供临时的物理庇护微环境，也未能整合益生元等营养组分来支持菌的初期黏附与增殖，导致“播种”后的存活率与定植稳定性难以保证。并且，传统制剂制备工艺与菌活性保存之间存在固有矛盾，如加热、交联或干燥等工序，极易损害菌的活性与遗传稳定性。

5、不难看出，现有治疗系统的设计思维单一，仅聚焦于“送达”本身，未能与后端治疗功能进行系统性整合，不具备对定植菌群功能的局部调控能力，无法响应肠道微环境信号来智能调控外泌体的分泌水平或成分，也未能协同递送可增强外泌体脑靶向性或调节局部免疫微环境的辅助成分，使得从“菌群定植”到“有效治疗”的转化链条存在效率瓶颈。无法满足整个策略依赖于活菌的长期稳定定植及其治疗性外泌体的持续、可控分泌来长期清除肠上皮细胞异常蛋白的功能。因此，开发一种能够克服上述多重障碍的新型口服肠溶递送系统，对于实现基于活菌-工程化外泌体的下一代中枢神经系统疾病疗法至关重要。

6、基于此，本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体，实现了工程菌的口服高效保护、肠道靶向定植及其后续治疗功能的程序化调控，为通过脑-肠轴途径治疗中枢神经系统疾病提供了变革性解决方案。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体及包含其的负载活菌-工程化外泌体的的口服肠溶制剂，以解决现有技术中的中枢神经系统疾病外泌体疗法口服递送与效能调控的多重瓶颈。

2、具体地，本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，第一方面，本发明提供了一种用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体，通过将异常蛋白降解肽及荧光蛋白序列的质粒与大肠杆菌感受态冰浴第一时间后立刻转入42°c金属浴第二时间，然后立即转入冰水混合物中冰浴第三时间，加入不含抗生素的液体培养基，然后在37°c摇床中温和振荡培养第四时间后获得菌液，在所述菌液中收集外泌体，即得所述用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体；

3、在所述菌液中收集外泌体的过程具体包括：

4、将所述菌液进行4℃、10000 g、1 h离心分离菌体，将得到上清液进行0.22um抽滤除菌，抽滤后的无菌溶液进行100kda超滤浓缩，浓缩后的溶液通过4℃、100000 g、1 h超离得到外泌体沉淀，将沉淀经无菌pbs重悬后再次4℃、100000 g、1 h超离后得到纯净的工程化外泌体。

5、在根据本发明所述的用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体的一实施方式中，所述异常蛋白降解肽包括protac、autac、attec、lytac。

6、在根据本发明所述的用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体的一实施方式中，所述荧光蛋白序列包括egfp、mcherry、mplum。

7、在根据本发明所述的用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体的一实施方式中，所述第一时间为10～30分钟。

8、在根据本发明所述的用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体的一实施方式中，所述第二时间为30～90秒。

9、在根据本发明所述的用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体的一实施方式中，所述第三时间为2～10分钟。

10、在根据本发明所述的用于清除肠道异常蛋白治疗神经系统疾病的工程化外泌体的一实施方式中，所述第四时间为45～60分钟。

11、第二方面，本发明提供了一种负载活菌-工程化外泌体的的口服肠溶制剂，所述口服肠溶制剂包括如上所述的工程化外泌体。

12、第三方面，本发明提供了一种负载活菌-工程化外泌体的的口服肠溶制剂的制备方法，包括如下步骤：

13、步骤一：将所述菌液通过抗生素平板培养基筛选阳性单克隆菌落，扩大培养单菌落并通过测序及wb鉴定阳性菌株；

14、步骤二：将步骤一鉴定后的阳性菌株扩大培养至od为0.6～0.8时，将菌液分装至西林瓶，并与肠溶制剂成分等体积混合均匀，-80℃预冻过夜后，通过真空冷冻干燥机冻干12～24小时。

15、在根据本发明所述的负载活菌-工程化外泌体的的口服肠溶制剂的制备方法的一实施方式中，所述肠溶制剂成分包括醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯（hpmcas）、海藻酸钠、明胶、脱脂奶粉、抗坏血酸钠、蔗糖。

16、与现有技术相比，本发明的积极效果是：

17、1、首先，针对现有口服活菌-工程化外泌体制剂普遍面临胃酸灭活及在非目标肠段无效释放的挑战。本发明核心优势之一在于其独特的“ph-酶-时间三重响应”凝胶递送系统，该系统并非依赖单一ph触发。首先，采用醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯（hpmcas）等结肠溶成分，可确保制剂在胃部及小肠上段完整；其次，通过结肠特异性酶（如偶氮还原酶、糖苷酶）敏感的多糖聚合物如壳聚糖、olz（奥沙拉嗪钠）等复合物，使得有效成分在结肠原位释放；最后，在活菌抵达结肠后，通过肠道内的纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶等菌群酶作用下，活菌凝胶网络发生特异性解离，并通过诱导剂进一步控制其外泌体的释放。该机制确保了超过90%的活性菌能完整递送至结肠，并在抵达结肠后精准释放有效外泌体。与传统肠溶技术相比，本发明不仅实现了递送位点的精确控制，其凝胶缓释特性更模拟了“微生物播种”的过程，为活菌竞争性占据生态位提供了关键的时间窗口；

18、具体地：本发明所构建的“三维网络”并非传统肠溶制剂的单一涂层结构，而是一套具有“ph-酶-时间”三重响应机制的智能水凝胶递送系统，这是本发明区别于现有技术的核心发明点之一。

19、首先，在结构组成上，本发明构建了由外层肠溶包衣与内层离子交联凝胶共同组成的三维聚合物网络系统。传统的肠溶包衣多依赖单一的ph响应机制，在胃肠道生理环境个体差异下极易发生提前崩解或延迟释放。相比之下，本发明的三维网络在胃液强酸环境及十二指肠高胆盐环境中能够维持结构的完整致密性：一方面通过物理屏障作用有效阻隔胃酸与胆盐的向内渗透，另一方面通过空间限域效应为包埋的活菌维持一个高渗透压的稳定微环境。这使得工程菌在穿越上消化道极端环境时能够保持代谢静止的“休眠”状态，从而实现了第一重响应——ph依赖的物理屏障与空间庇护。

20、其次，在释放动力学设计上，本发明摒弃了单纯依靠ph变化触发崩解的策略，而是创造性地利用了结肠微环境特有的多糖降解酶系。所述三维凝胶网络在经历胃及小肠的ph波动后不会发生明显溶胀或崩解，仅当制剂抵达结肠部位后，在结肠菌群所分泌的特异性多糖降解酶（如纤维素酶、果胶酶等）的作用下，凝胶网络才发生特异性降解与原位解离，从而实现工程菌的结肠靶向释放与初期定植。此即为本发明的第二重响应——酶触发的结肠精准定位释放。

21、第三，在治疗功能的启动控制上，本发明进一步引入了时间维度的精密调控。工程菌完成靶向释放与定植后，并非处于不可控的随意分泌状态。本发明通过引入特定的外源性诱导剂（包括但不限于iptg、l-阿拉伯糖、ahls等），在预设的特定时间节点（例如通过分次服药或制剂分层崩解）精准触发工程菌体内的转录调控元件，从而启动异常蛋白降解肽及治疗性外泌体的原位合成与分泌。此即为本发明的第三重响应——诱导剂依赖的时间门控表达。

22、第四，本发明中“诱导剂”的选择与肠道响应释放机制的结合是本发明的重要功能性创新。所述的诱导剂具体指包括但不限于iptg（异丙基-β-d-硫代半乳糖苷）（0.1mm～1.0mm）、l-阿拉伯糖（0.05%～0.2%（w/v））、ahls（酰基高丝氨酸内酯类）（10nm～1μm）等小分子信号物质，诱导剂使用方法包括灌胃和口服。本发明的创新之处在于：现有的微生态制剂疗法普遍缺乏对定植后治疗性物质分泌水平和时空的可控性调控。本发明通过引入外源诱导响应机制，建立了活菌定植过程与药效物质（工程化外泌体）分泌过程的解耦控制。该系统允许在载体完成肠道靶向递送与定植后，通过施加特定诱导信号分子，精准启动靶向异常蛋白降解肽及荧光蛋白的原位合成与外泌体包裹释放，实现了药物局部浓度的按需程序化调控。这种 “肠道原位诱导表达-原位分泌-原位治疗” 的策略，有效规避了体外纯化外泌体成本高、体内半衰期短的行业难题。

23、对于其中的“诱导剂”的具体使用如下：诱导剂是指口服工程菌之后，在需要工程菌释放活性外泌体的时候口服诱导剂，使得活菌可以通过外源物质的调控，释放有治疗功能的外泌体，实现肠道外源诱导响应机制；具体步骤如下：

24、静默定植：口服工程菌后，无诱导剂时阻遏蛋白结合操纵子，目标有治疗功能基因不表达，工程菌在肠道安静定植，避免持续刺激引起免疫耐受。

25、按需诱导：当需要治疗时，口服或灌胃外源诱导剂，诱导剂到达肠道与工程菌内调控蛋白结合→解除阻遏→启动下游基因转录→细菌合成并分泌携带活性的外泌体。

26、使用诱导剂的创新之处在于：现有的微生态制剂疗法普遍缺乏对定植后治疗性物质分泌水平和时空的可控性调控。本发明通过引入外源诱导响应机制，建立了活菌定植过程与药效物质（工程化外泌体）分泌过程的解耦控制。该系统允许在载体完成肠道靶向递送与定植后，通过施加特定诱导信号分子，精准启动靶向异常蛋白降解肽及荧光蛋白的原位合成与外泌体包裹释放，实现了药物局部浓度的按需程序化调控。这种 “肠道原位诱导表达-原位分泌-原位治疗” 的策略，有效规避了体外纯化外泌体成本高、体内半衰期短的行业难题。

27、综上所述，本发明独创的“ph响应型物理屏障（空间保护）— 结肠酶响应型降解（靶向定位）— 诱导剂时间门控表达（功能启动）”三重级联调控机制，协同实现了工程菌从口腔摄入、上消化道保护、结肠精准定植到治疗功能定时启动的全链条精准控制。这一创新的三维网络设计理念显著提升了活菌向结肠靶点递送的空间精确度与存活率，并解决了传统活体生物制剂在体内释放不可控的行业共性难题，其技术效果是本领域技术人员基于现有技术无法合理预期的。

28、2、其次，针对现有技术中将递送载体与活菌功能视为独立模块的缺陷，本发明最大的突破在于将肠溶制剂从被动“容器”革新为主动“启动平台”与“信号调节器”。凝胶基质在结肠释放后，其水化形成的三维网络不仅为工程菌提供物理庇护，其自身更是由预载的特定益生元（如低聚果糖）、黏附增强肽（如黏附素类似物）及ph敏感的营养微球组成。这一设计主动塑造了一个利于活菌初期存活、黏附与增殖的局部微环境，从“递送”跃升至“培育”，确保其能持续不断产生针对肠上皮异常蛋白有清除效果的工程化外泌体。

29、3、最后，本发明在规模化生产与产品稳定性方面具有显著优势。采用低温原位离子交联与温和乳化包封技术，完全避免了高温、有机溶剂或剧烈剪切对工程菌活力的损伤，实现了高活菌载量的高效包封。同时，通过精确调控凝胶基质的玻璃化转变温度与水分活度，配合真空冷冻干燥工艺，可制备出在常温下长期稳定储存的固态制剂，使用时能快速水化恢复功能，解决了活菌制剂储存稳定性与冷链运输依赖的难题；

30、该“低温原位离子交联”与“温和乳化包封”的组合工艺策略是本发明在制剂工程学层面的重要技术创新，其核心实施路径分为两个连续阶段——首先，采用直接挤出法将含有目标菌液与海藻酸钠的混合体系匀速滴入氯化钙固化液中，利用海藻酸钠分子链上多聚古洛糖醛酸片段的游离羧基与二价钙离子在低温或室温水相环境中瞬间发生配位交联反应，自发形成经典的“蛋盒”结构三维网状水凝胶微球，从而在不引入高温、有机溶剂或高剪切力的条件下实现对菌体的原位瞬时包裹，从物理加工层面最大程度规避了细胞膜相变、蛋白质变性及质粒dna降解风险，保障了工程菌的初始存活率与遗传物质稳定性；随后，将上述离子交联制得的凝胶微球转移至含0.5%～1.5%壳聚糖的水溶液中进行温和乳化包封处理并真空冷冻干燥，该过程依托聚电解质络合反应机制，利用内核海藻酸钠表面的阴离子羧酸根与外相壳聚糖分子链上的阳离子氨基之间产生静电自组装，在微球表面均匀沉积形成致密聚合物包衣层，全程在水相体系中完成，既彻底消除了传统乳化法中有机溶剂残留对活菌的化学毒性杀伤，又因无需高剪切均质设备而有效避免了机械应力对细菌细胞壁造成的不可逆物理撕裂。

31、本发明独创的“低温原位离子交联”与“温和乳化包封”组合工艺通过钙离子配位交联与聚电解质静电自组装两种温和的理化机制，系统性地规避了传统微球制备工艺中“高温、有机溶剂、高剪切力”三大破坏性因素，从制剂工程学角度确保了冻干产品具备高活菌载量与高生物相容性，是实现后续工程菌在肠道内高效定植并原位分泌治疗性外泌体的关键工艺前提。

32、总结：本发明公开的负载活菌-工程化外泌体的的口服肠溶制剂，通过其结肠精准递送、智能定植支持与治疗功能程序化耦合的核心设计，系统性解决了中枢神经系统疾病外泌体疗法口服递送与效能调控的多重瓶颈。该发明不仅为神经退行性疾病提供了一种全新的、可口服的、长效的“活性外泌体工厂”治疗模式，也为其他基于“肠-脑轴”外泌体干预的疾病治疗策略提供了创新的技术平台，具有重大的临床转化潜力与商业价值。