一种CP23单抗杂交瘤细胞株及其单抗在制备快速检测微小隐孢子虫胶体金试纸条中的应用

本发明涉及生物与病原检测，具体而言，涉及一种cp23单抗杂交瘤细胞株及其单抗在制备快速检测微小隐孢子虫胶体金试纸条中的应用。

背景技术：

1、隐孢子虫（

cryptosporidiumspp.）是重要的人兽共患寄生原虫，可引起人和多种动物出现不同程度的腹泻，甚至出现死亡。其中微小隐孢子虫（

cryptosporidium parvum‌）作为高致病性虫种，是导致人和动物的腹泻病暴发的主要病原体。其生活史复杂，包括滋养体、裂殖体、配子体和卵囊等多个发育阶段，成熟卵囊具有较强的环境抵抗力，水源性传播和食源性传播是其关键的两种传播途径。近年来，微小隐孢子虫是引起犊牛大规模腹泻暴发的主要病原，且具有显著的地域亚型差异。硝唑尼特是目前美国食品药品监督管理局（fda）唯一批准用于治疗的药物，但疗效具有一定局限性。因此，及时准确地检测微小隐孢子虫，对于快速诊断和控制隐孢子虫病至关重要。

2、目前国内外现有检测方法操作繁琐、依赖昂贵仪器设备，商用试剂盒依赖进口且价格昂贵，不适用于现场快速检测和大批量样本筛查。现有检测微小隐孢子虫的免疫层析方法，虽然具有快速、简便的优点，但也存在一些关键的局限性，主要包括灵敏度不足、特异性与交叉反应风险、虫种覆盖范围有限等功能缺陷。而要在粪便样品中及时准确地检测微小隐孢子虫仍面临多重挑战：如微小隐孢子虫卵囊微小，且形态与粪便中的其他成分或寄生虫（如微孢子虫）相似，容易混淆导致误诊；排出量少且不稳定会出现假阴性结果；由于检测结果的准确性高度依赖样本质量，通常要求使用新鲜粪便，而粪便样本成分复杂、干扰检测，也会产生假阳性结果，而现有研究采用的试剂盒或检测方法各异，导致结果难以横向比较。

3、实现粪便中微小隐孢子虫的快速检测，核心难点在于需要同时满足“快”和“准”两个要求。快速方法（如ict）在灵敏度上存在短板，而准确的方法（如pcr）又难以满足快速、简便的需求。如现有研究公开的微小隐孢子虫病抗体检测试纸条依赖于微小隐孢子虫cp23-gp15串联重组蛋白，该方案是利用重组蛋白对病原体感染后的抗体进行检测，其检测灵敏性不高，且该技术必须同时使用cp23和gp15抗原进行elisa检测才能有效降低假阴性、提高检出率。而现有商业试剂盒如萨卫亚®隐孢子虫快速检测试剂盒、xpecttm隐孢子虫检测试剂盒等，普遍灵敏度达85%，特异性为90%以上，但价格昂贵且货期长。目前国内仍缺乏能现场即时快速检测微小隐孢子虫病原体本身（特异性抗原）的方法和产品，难以满足临床早期诊断和流行病学筛查的实际需求。

4、为了克服现有技术存在的上述问题，建立更加快速、准确的胶体金免疫层析检测试纸条产品以及方法，对实现对隐孢子虫病的早期诊断和快速筛查具有重要意义，由此提出本发明申请。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种cp23单抗杂交瘤细胞株及其单抗在制备快速检测微小隐孢子虫胶体金试纸条中的应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种cp23单抗杂交瘤细胞株44h1-1。

3、本发明的第二个目的是提供一种cp23单克隆抗体。

4、本发明的第三个目的是提供cp23单克隆抗体的制备方法。

5、本发明的第四个目的是提供cp23单抗杂交瘤细胞株44h1-1或cp23单克隆抗体的应用。

6、本发明的第五个目的是提供一种快速检测微小隐孢子的虫胶体金试纸条。

7、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

8、本发明提供一种cp23单抗杂交瘤细胞株（

mus musculus hybridoma）44h1-1，该杂交瘤细胞株44h1-1已于2026年8月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.68357。

9、本发明以微小隐孢子虫分泌型抗原cp23（由4号染色体上的cgd4_3620基因编码）为靶标，过杂交瘤技术进行细胞融合和亚克隆筛选，最终筛选鉴定得到能稳定分泌抗体的细胞株44h1-1，抗体亚型为igg1，轻链均为κ。基于改细胞株制得的单抗能识别特定抗原的单一表位，其批间一致性和质量可控性更高。同时以抗cp23多克隆抗体作为金标抗体，抗cp23单克隆抗体44h1-1作为检测线抗体，建立了可用于临床粪便样本中微小隐孢子虫检测和鉴定的胶体金免疫层析检测试纸条。基于该试纸条能快速检测粪便样品中微小隐孢子虫，仅需10~15 min即可获得结果，检测限为1×104个卵囊/克粪便，灵敏度较高；与人隐孢子虫、球虫等其他病原无交叉反应，特异性良好；试纸条在低温（4℃）和室温（25℃）条件下均可存放>2个月，稳定性良好。采用该试纸条检测60份粪便样品，以巢式pcr检测结果为参照，其灵敏度为90.9%，特异性为93.9%，适用于临床粪便样本中微小隐孢子虫的现场快速筛查。本发明基于cp23单抗杂交瘤细胞株44h1-1成功建立了一种新的基于微小隐孢子虫cp23蛋白的胶体金免疫层析检测方法，具有较高的灵敏度、特异性和稳定性，且无需专业设备，为隐孢子虫病的早期诊断和批量筛查提供技术支持。

10、本发明提供一种cp23单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株44h1-1制得。

11、本发明提供cp23单克隆抗体的制备方法，在实验小鼠腹腔中注射细胞株44h1-1，收集小鼠腹水，离心后取上清液，纯化后获得单克隆抗体。具体为：在实验小鼠腹腔注射降植烷的7天后，在其腹腔注射杂交瘤细胞株44h1-1，待小鼠腹腔明显隆起时收集小鼠腹水，将腹水离心后取上清液经纯化后即获得cp23单克隆抗体。

12、本发明提供上述杂交瘤细胞株或cp23单克隆抗体在非疾病治疗诊断为目的检测微小隐孢子虫、或在制备快速检测微小隐孢子虫的产品中的应用。

13、优选地，所述产品为检测试剂盒或胶体金试纸条。

14、本发明提供一种快速检测微小隐孢子虫的胶体金试纸条，试纸条的检测线上包被的检测抗体为上述制得的cp23单克隆抗体。

15、本发明提供的胶体金试纸条通过夹心法进行检测，通过点样技术将特异性抗体和质控抗体（如羊抗兔/鼠igg）固定在硝酸纤维素膜（nc膜）上，检测线t线上包被cp23单克隆抗体，质控线c线上包被山羊抗兔igg，探针采用cp23兔多克隆抗体，将探针与待测样品混合后，会与样品中的抗原结合形成抗原抗体复合物，再将试纸条插入待测样品处理溶液中，抗原抗体复合物会和检测线上包被的单抗结合形成“抗体-抗原-抗体”的夹心结构，发生特异性结合并显色，阳性结果表现为质控线（c线）和检测线（t线）同时显色，t线显色程度和样品抗原浓度呈正相关。

16、优选地，所述探针采用胶体金标记的cp23兔源多克隆抗体，质控线包被有羊抗兔/鼠igg。

17、更优选地，所述cp23兔源多克隆抗体由cp23重组蛋白对新西兰大白兔进行免疫注射后获得的兔源多克隆抗体血清，再进行纯化后获得。

18、进一步优选地，所述cp23兔源多克隆抗体的制备方法为：

19、（1）动物免疫：取cp23重组蛋白与等体积佐剂混合，乳化后对新西兰大白兔进行背部皮下多点注射免疫，首次免疫后第14、21、28天分别进行第二至第四次免疫；第四次免疫后第7天耳缘静脉采血并分离血清，获得兔源多克隆抗体血清；

20、（2）多克隆抗体纯化：取proteina+g agarose装柱，tbs缓冲液平衡柱子，步骤(1)所得的兔源多克隆抗体血清过0.45μm滤膜后加入层析柱中，颠倒混匀，而后tbs缓冲液漂洗，洗脱非特异杂蛋白，再用甘氨酸洗脱抗体，收集的抗体超滤浓缩，pbs缓冲液换液，获得所述的抗cp23兔多克隆抗体。

21、更优选地，所述探针采用的cp23兔源多克隆抗体浓度为50~200 μg/ml。

22、优选地，所述试纸条还含胶体金标记的探针、检测线、质控线、样品垫、吸水纸、nc膜和pvc底板。

23、进一步地，所述检测产品中除了试纸条，还含有其他检测试剂，如样品稀释液、抗体稀释液、样品垫处理液、封闭剂、探针溶液。

24、更优选地，所述探针溶液的制备方法为：取胶体金溶液调节ph至8，加入100 μg/mlcp23兔多克隆抗体，混匀，室温静置20 min，加入封闭剂，室温封闭20 min，4℃，离心20min，弃上清，再加入胶体金标记的cp23兔源多克隆抗体复溶液，混匀即得探针。

25、优选地，所述样品稀释液：在0.5 g bsa粉末中加入50 mlpbs和250 μl tween-20即得。

26、优选地，所述样品垫处理液：5 ml 10% bsa、5 ml 10% pvp、3 ml 10% tween-20、20 ml 0.5 mol/l ph 7.4磷酸缓冲液和67 ml超纯水。

27、优选地，所述封闭剂选自10% bsa、10% peg2000、10%脱脂奶粉或10%甘氨酸。

28、更优选地，所述封闭剂为10% peg2000。

29、优选地，所述最佳抗体稀释液为0.5% bsa。

30、优选地，所述采用金标抗体的ph值为7~9，标记浓度为5~15 μg/ml。

31、更优选地，金标抗体的ph值为8，标记浓度为10 μg/ml。

32、优选地，所述c线和t线抗体的包被浓度为0.25~1 mg/ml。

33、更优选地，c线最佳浓度为0.5 mg/ml，t线最佳浓度为0.5 mg/ml。

34、优选地，所述胶体金试纸条的制备方法包括如下步骤：

35、（1）样品垫前处理：裁剪为宽15 mm，使用样品垫处理液浸润样品垫，37℃过夜烘干12 h，密封室温保存；

36、（2）nc膜抗体包被：使用划膜仪将抗cp23鼠源单克隆抗体包被于nc膜上作为t线，将山羊抗兔igg抗体包被于nc膜上作为c线，37℃过夜干燥；

37、（3）吸水纸前处理：裁剪宽25 mm，密封室温保存；

38、（4）组装：将样品垫、nc膜和吸水纸重叠组装于pvc底板上，密封室温存放，保持干燥。

39、本发明还提供一种快速检测粪便样品中微小隐孢子虫的方法，将粪便样品加入样品稀释液搅拌均匀，离心后取粪便上清，用样品稀释液稀释4~128倍后加入探针，孵育5~10min；随后将试纸条插入，室温静置10~15 min，待试纸条上c线和t线颜色稳定，观察显色情况，若c线和t线均显色则判为阳性；若c线显色，但t线不显色则判为阴性；若无c线出现，则本次结果无效，需重新检测。

40、因此，本发明还提供抗cp23兔多克隆抗体在制备微小隐孢子快速检测产品中的应用。

41、本发明具有以下有益效果：

42、本发明以微小隐孢子虫分泌型抗原cp23为靶标，过杂交瘤技术得到能稳定分泌抗体的细胞株44h1-1，基于该细胞株制得的cp23单克隆抗体建立了可用于临床粪便样本中微小隐孢子虫检测和鉴定的胶体金免疫层析检测试纸条，该试纸条具有良好的特异性和灵敏度，无需依赖昂贵的仪器设备，且其制备原料简单，成本较低，在10~15分钟内即可完成检测并读取检测结果，适用于临床初筛和现场快速检测。该试纸条的检测限为1×104个卵囊/克粪便，灵敏度较高；与人隐孢子虫、球虫等其他病原无交叉反应，特异性良好；试纸条在低温（4℃）和室温（25℃）条件下均可存放>2个月，稳定性良好。采用该方法检测60份粪便样品，以巢式pcr检测结果为参照，其灵敏度为90.9%，特异性为93.9%，表明该方法适用于临床粪便样本中微小隐孢子虫的现场快速筛查。本发明为隐孢子虫早期临床诊断、流行病学大规模筛查提供简便、快速的现场检测技术支撑。