一种鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗及其卵黄抗体制备方法与流程

本技术涉及生物，尤其涉及一种鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗及其卵黄抗体制备方法。

背景技术：

1、鹅呼肠孤病毒病（goose reovirus, grv），是2001年以来养鹅业出现的一种疾病，俗称“肝白点病”或“鹅坏死性肝炎”，主要危害1-10周龄雏鹅，尤其2-4周龄雏鹅多发，引起鹅出血性、坏死性肝炎，剖检主要表现是肝脏有大小不一、散在性或弥漫性的出血斑或淡黄色、灰黄色的坏死斑点，脾脏肿大，质地较硬，有大小不一的坏死斑点。该病的发病率与死亡率与鹅日龄密切相关，4周龄以内雏鹅发病率达70%以上，死亡率可达60%。同时鹅呼肠孤病毒还会引起鹅的免疫抑制，影响其他疾病的预防和治疗效果。

2、鹅呼肠孤病毒属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，为无囊膜、双层衣壳、二十面体对称的球形病毒粒子，直径约70-85 nm。σc蛋白是鹅呼肠孤病毒外壳的主要细胞吸附蛋白，也是诱导型特异性中和抗体的主要靶抗原。σc蛋白天然状态为同源三聚体，n端为α-螺旋卷曲螺旋结构，蛋白中间颈部约44个氨基酸（95-134位氨基酸）为铰链区，c端为球形头部受体结合域，是决定病毒宿主范围、诱导细胞凋亡的关键蛋白。

3、基因分型与血清学交叉中和试验结果表明，鸭源和鹅源呼肠孤病毒存在显著差异，直接用鸭源疫苗或者卵黄抗体防控鹅呼肠孤病毒感染可能效果不佳。目前针对鹅呼肠孤病毒的专门疫苗和卵黄抗体研发仍处于起步阶段，开展基于鹅源毒株的预防性疫苗和治疗性卵黄抗体研究具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗及其卵黄抗体制备方法。该制备方法优选的鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗免疫蛋鸡后可显著提高蛋黄中鹅呼肠孤病毒中和抗体效价，有效降低鹅呼肠孤病毒卵黄抗体的生产成本，对鹅呼肠孤病毒病的预防及治疗极具应用价值。

2、一方面，本技术提供了一种鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体，所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体包含相对于参比序列（genbank登录号：or890080）第104位的脯氨酸残基突变为丙氨酸残基、第110位的甘氨酸残基突变为丙氨酸残基和第118位的脯氨酸残基突变为丙氨酸残基，所述参比序列如seq id no.1所示。

3、进一步地，所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、优选的，所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体相比参比序列σc蛋白，增加了铰链区的稳定性，使其c端头部区域能更好的与细胞受体结合，增加了σc蛋白的免疫原性。

5、另一方面，本技术还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含所述的鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体和幽门螺杆菌铁蛋白。

6、优选的，所述融合蛋白可自发形成纳米颗粒。

7、优选的，所述幽门螺杆菌铁蛋白genbank登录号：wp_121095584。

8、优选的，所述的鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体和幽门螺杆菌铁蛋白用lingker连接，所述lingker的序列如seq id no.6所示。

9、优选的，所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体的n端用lingker与幽门螺杆菌铁蛋白连接。

10、进一步地，所述融合蛋白包含如seq id no.3所示氨基酸序列或与seq id no.3具有至少98%的序列同一性的氨基酸序列。

11、对于亚单位疫苗来说，纳米颗粒制备的疫苗比常规蛋白疫苗更易于被机体免疫细胞识别和激活，从而具有更好的免疫效果。

12、另一方面，本技术还提供了生物材料，所述生物材料包括如下a1）-a4）任一种：

13、a1）核酸分子，所述核酸分子含有编码所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白的核酸分子；

14、a2）表达盒，所述表达盒含有a1）所述核酸分子；

15、a3）重组载体，所述重组载体含有a1）所述核酸分子或a2）所述表达盒；

16、a4）宿主细胞，所述宿主细胞含有a1）所述核酸分子、a2）所述表达盒或a3）所述重组载体。

17、进一步地，编码所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体的一种核苷酸序列，如seq idno.4序列所示。

18、进一步地，编码所述融合蛋白的一种核苷酸序列，如seq id no.5序列所示。

19、本技术所述表达盒中还可包含启动子、终止子、标记基因等功能性元件，本领域技术人员可根据实际情况进行常规选择，只要能够完成a1）核酸分子的表达即可，此处不再对表达盒的结构及组成进行过多限制。

20、本技术所述载体是指能够把外源dna或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是任何便于进行重组dna操作并表达核酸序列的载体（例如质粒或病毒）。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制型载体（即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制），例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部dna的两个或多个载体或质粒，或转座子，本领域技术人员可根据实际情况进行选择，此处不进行过多限制。

21、优选的，所述质粒为pet30a质粒。

22、进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母中的一种或多种。

23、优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌（

escherichia coli）。

24、在一种优选的实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21（de3）。

25、本领域技术人员可采用常规培养方法培养上述宿主细胞。

26、在一种可选的实施方式中，重组载体和宿主细胞中含有抗性筛选标记基因，本领域技术人员可根据实际情况进行选择，本技术中不对抗性筛选标记基因进行强制性的限定。

27、抗性筛选标记基因是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性、或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记等。

28、另一方面，本技术还提供了所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白的一种制备方法，所述方法包括：构建表达鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白的宿主细胞，发酵宿主细胞，获得所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白。

29、优选的，所述方法包括：

30、步骤一、构建表达鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白的宿主细胞；

31、步骤二、取所述宿主细胞接种于种子培养基25℃-40℃，培养8-10 h，获得种子液；

32、步骤三、以接种量为1-5％接种种子液于发酵培养基，25℃-40℃通气培养，待菌液的od600值达到6-8时，加入2-10 g/l的α-乳糖诱导，再继续培养6-8 h，通过转速关联控制溶氧，当溶氧迅速上升时，流加补料培养基；

33、步骤四、离心收集菌体，破碎菌体，离心，收集上清液。

34、所述离心和破碎条件可根据蛋白大小和菌体情况进行调整，此处不做具体限定。

35、优选的，所述种子培养基为lb培养基。

36、优选的，所述发酵培养基包括胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、葡萄糖、mgso4·7h2o。

37、优选的，所述补料培养基包括胰蛋白胨、酵母浸粉、甘油。

38、优选的，所述方法还包括纯化的步骤，本领域技术人员可采用常规方法进行纯化。

39、在一种优选的实施方式中，所述纯化为镍柱层析纯化。

40、优选的，所述方法还包括灭活的步骤。更优选的，所述灭活方法为加入甲醛灭活。

41、另一方面，本技术还提供了所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白在制备亚单位疫苗中的应用。

42、另一方面，本技术还提供了亚单位疫苗的制备方法，所述方法包括：将所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白与辅料混合，制备成亚单位疫苗。

43、优选的，

44、步骤一、利用宿主细胞获得所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白；

45、步骤二、将所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白制备成亚单位疫苗。

46、本领域技术人员可以理解的是，可采用常规发酵菌种或任一已知工业菌种作为出发菌株（宿主细胞），只要能够完成本技术所述的突变体或融合蛋白的表达即可，此处对具体菌株不做过多限定。

47、优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌（

escherichia coli）。

48、在一种优选的实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21（de3）。

49、并且，培养所述宿主细胞的方法可采用宿主细胞常规培养方法进行培养。

50、在一种优选的实施方式中，所述方法包括：

51、步骤一、构建表达鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白的宿主细胞，发酵宿主细胞，获得所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白；

52、步骤二、取所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白、吐温-80混合获得水相；取白油、硬脂酸铝、司本-80，加热混合获得油相；

53、步骤三、将油相和水相混合乳化，获得鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗。

54、优选的，

55、步骤一、构建表达鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白的宿主细胞，发酵宿主细胞，获得所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白；

56、步骤二、取所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白、吐温-80混合获得水相，所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白与吐温-80的质量比为96：4；取白油、硬脂酸铝、司本-80，白油、硬脂酸铝、司本-80的质量比为94:2:6，125℃-130℃加热混合获得油相；

57、步骤三、将油相和水相按照质量比为2:1混合，3600 r/min乳化40 min，获得鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗。

58、另一方面，本技术还提供了一种鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗，所述鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗包含所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白。

59、优选的，所述鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗中所述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白的浓度范围上限或下限可为0.1-10 mg/ml中任一数值。

60、本领域技术人员可根据实际情况进行调整。

61、更优选的，0.6 mg/ml。

62、所述鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗四免后7日抗体效价不低于1:512，最高可达1:1024，且抗体持续时间长，四免后60日进行检测，鸡蛋的卵黄抗体效价仍符合要求。

63、另一方面，本技术还提供了一种鹅呼肠孤病毒卵黄抗体的制备方法，所述方法包括：采用所述的鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗免疫蛋鸡。

64、所述采用所述的鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗免疫蛋鸡的方法可采用常规免疫方法。

65、优选的，所述方法包括：

66、步骤一、采用颈部皮下方式注射免疫，共四次免疫，具体的，第一次免疫注射0.4ml/只，第二次免疫注射0.8 ml/只，第三次免疫注射1.0 ml/只，第四次免疫注射1.0 ml/只，每次间隔14天；

67、步骤二、收集鸡蛋，所述鸡蛋抗体效价不低于1:512，蛋壳消毒后进行卵黄分离、辛酸萃取、灭活、过滤除菌、稀释分装，制备成鹅呼肠孤病毒卵黄抗体。

68、另一方面，本技术还提供了所述的制备方法获得的鹅呼肠孤病毒卵黄抗体。

69、优选的，所述鹅呼肠孤病毒卵黄抗体效价不低于1:256。

70、所述鹅呼肠孤病毒卵黄抗体安全性高，且具有明确的防控效果，可有效防治鹅呼肠孤病毒病。

71、另一方面，本技术还提供了所述的鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或所述融合蛋白或所述生物材料或所述鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗或所述鹅呼肠孤病毒卵黄抗体在制备防治鹅呼肠孤病毒药品中的应用。

72、本发明具有如下有益效果：

73、本发明中首次发现鹅呼肠孤病毒σc蛋白铰链区第104位、第110位、第118位氨基酸对σc蛋白的结构有重要作用，定向突变增加刚性后获得的重组鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体免疫原性大幅提高。近一步将其与幽门螺杆菌铁蛋白结合，可获得一种能够自发形成纳米颗粒的融合蛋白，将融合蛋白制备成疫苗免疫蛋鸡后，产生的特异性卵黄抗体的效价更高、持续期更长。

74、利用上述鹅呼肠孤病毒σc蛋白突变体或融合蛋白可制备获得免疫性能优异的鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗和鹅呼肠孤病毒卵黄抗体。

75、与常规制备方法相比，本发明的鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗免疫蛋鸡，在中和抗体产生高度及中和抗体持续期方面，均远优于参比σc蛋白疫苗组、常规的全病毒灭活苗组。本发明的实施可以大大降低鹅呼肠孤病毒卵黄抗体的制备成本，极具推广与应用价值。

76、将本发明的鹅呼肠孤病毒亚单位疫苗免疫蛋鸡后提取的鹅呼肠孤病毒卵黄抗体对雏鹅开展预防与治疗试验。结果预防组、治疗组的鹅群对强毒攻毒分别达到100%、90%保护，而攻毒对照组雏鹅则100%发病，证明本发明制备的卵黄抗体对感染鹅呼肠孤病毒的鹅群具有良好的保护效果，可进行临床推广和应用。