一种抗三唑磷重组抗体和应用

本发明涉及基因工程和免疫检测，特别涉及一种抗三唑磷重组抗体和应用。

背景技术：

1、三唑磷（triazophos，tap）是一种广泛使用的有机磷杀虫剂，曾广泛应用于水稻、蔬菜、果树等农作物病虫害防治。由于其具有较高的生物毒性和环境风险，残留物可通过农产品、动物源性食品及环境介质进入食物链，对生态环境及人体健康造成潜在危害。因此，建立快速、准确和高灵敏度的三唑磷残留检测技术一直是食品安全和环境监测领域的重要研究方向。目前，三唑磷残留检测技术主要包括仪器分析方法和免疫分析方法两大类。1.仪器分析技术：现有仪器分析技术主要包括气相色谱法（gc）、气相色谱-质谱联用法（gc-ms）、高效液相色谱法（hplc）及液相色谱串联质谱法（lc-ms/ms）等。其基本原理为：样品经提取、净化后，通过色谱系统实现目标化合物与杂质分离，再利用检测器或质谱系统对目标化合物进行定性和定量分析。上述方法具有灵敏度高、准确性好和定量能力强等优点，目前已成为三唑磷残留检测的重要参考方法。但该类方法仍存在如下缺陷：（1）仪器设备价格昂贵，运行维护成本高；（2）样品前处理过程复杂；（3）检测周期较长；（4）对操作人员专业技术要求较高；（5）难以满足基层监管和现场快速筛查需求。因此，其在大规模样品快速检测领域受到一定限制。2.基于单克隆抗体的免疫分析技术：为解决仪器分析方法存在的问题，研究人员开发了基于抗原抗体特异性识别反应的免疫分析技术，包括酶联免疫吸附测定（elisa）、胶体金免疫层析、荧光免疫分析及化学发光免疫分析等。该类方法的核心在于获得高亲和力、高特异性的抗三唑磷抗体。目前公开的抗三唑磷抗体主要通过杂交瘤技术获得，其工艺流程通常包括：（1）三唑磷半抗原设计与合成；（2）半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原；（3）免疫balb/c小鼠；（4）脾细胞与骨髓瘤细胞融合；（5）杂交瘤筛选与亚克隆；（6）腹水诱生或体外培养制备单克隆抗体；（7）抗体纯化及免疫分析应用。该技术路线已经成功获得多种抗三唑磷单克隆抗体，并建立了相应免疫检测方法。然而，传统杂交瘤抗体技术仍存在以下不足：（1）抗体生产依赖杂交瘤细胞株长期培养与保存；（2）细胞连续传代过程中可能出现遗传漂移、染色体不稳定及抗体表达下降现象；（3）细胞污染、冻存失活或细胞丢失可能导致抗体资源无法恢复；（4）不同批次腹水制备过程存在一定差异，影响抗体一致性；（5）动物腹水生产方式存在动物伦理及生产成本问题。

2、目前现有技术仍存在上述问题的原因在于：（1）三唑磷属于小分子半抗原，其免疫原性较弱，高性能抗体筛选难度较大；（2）抗体亲和力和特异性受免疫原设计、动物个体差异及筛选策略影响显著；（3）抗体重链和轻链可变区序列决定其抗原识别能力，而目前公开可直接用于工程化开发的抗三唑磷vh/vl序列资源仍较有限；（4）缺乏兼具高亲和力、高特异性和良好重组表达性能的抗三唑磷抗体序列资源。此外，已公开的抗三唑磷抗体序列资源相对有限，能够兼具较高亲和力、良好特异性和重组表达能力的抗体序列较少，限制了其在免疫检测、试剂盒开发及产业化生产中的进一步应用。

3、因此，本发明旨在提供一种抗三唑磷重组抗体和应用，明确并扩增重组抗体的重链全长基因和轻链全长基因序列，建立稳定的重组表达体系，为三唑磷残留检测提供新的核心抗体资源。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述缺陷，本发明提出一种抗三唑磷重组抗体和应用，以解决上述背景技术提出的问题。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种抗三唑磷重组抗体，所述抗三唑磷重组抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示。

4、优选地，所述重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列来源于保藏编号为gdmcc no：68914、分类学名称为

murine hybridoma cell line的杂交瘤细胞，实验室命名为

murine hybridoma cell line24d；保藏地址：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2026年8月28日。

5、本发明提供一种制备所述抗三唑磷重组抗体的方法，包括以下步骤：

6、（1）从保藏编号为gdmcc no：68914，分类学名称为

murine hybridoma cell line的杂交瘤细胞中提取总rna，反转录得到cdna；

7、（2）以步骤（1）所得cdna为模板，扩增重链全长基因和轻链全长基因；所述重链全长基因编码的重链包含氨基酸序列如seq id no.1所示的重链可变区和氨基酸序列如seqid no.5所示的重链恒定区，所述轻链全长基因编码的轻链包含氨基酸序列如seq id no.3所示的轻链可变区和氨基酸序列如seq id no.7所示的轻链恒定区；

8、（3）将步骤（2）所得重链全长基因和轻链全长基因克隆到真核表达载体中，构建重组质粒；

9、（4）将步骤（3）所得重组质粒转染到宿主细胞中培养，收集培养上清，获得抗三唑磷重组抗体。

10、优选地，所述真核表达载体选自pcdna3.4、pcaggs或ptt5中的任意一种。

11、优选地，所述宿主细胞为hek293f细胞。

12、优选地，所述重链的n端具有第一信号肽，所述轻链的n端具有第二信号肽；所述第一信号肽和所述第二信号肽各自独立地选自：seq id no.9所示的小鼠iggκ信号肽、seq idno.10所示的tpa信号肽、seq id no.11所示的天然信号肽、seq id no.12所示的天然信号肽或seq id no.13所示的工程化信号肽。

13、优选地，步骤（4）所述转染中dna与聚乙烯亚胺（pei）的质量比选自1:3、1:4或1:6中的任意一种。

14、优选地，步骤（4）所述转染中重轻链的质量比选自1:1、2:3或3:2中的任意一种。

15、本发明提供了所述的抗三唑磷重组抗体在检测样品中三唑磷残留中的应用。

16、优选地，所述样品包括稻田水、鸡肉和豇豆中的任意一种或多种。

17、本发明还提供了所述的抗三唑磷重组抗体在制备检测三唑磷产品上的应用。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

19、（1）通过序列形式与表达载体的组合筛选、信号肽筛选及转染条件的逐级优化，最终确立了重组抗体的最优表达策略：采用全长野生型序列、pcdna3.4载体及小鼠iggκ信号肽，在hek293f细胞中以c品牌转染试剂、重轻链质量比为2:3、dna与聚乙烯亚胺（pei）质量比为1:6的条件进行瞬时转染；基于上述策略，成功获得高亲和力r-mab 24d，在优化条件下抗体表达量达到354μg/ml，说明本研究建立的表达体系具有较高的表达效率；

20、（2）采用间接竞争elisa评价抗体性能，发现重组抗体r-mab 24d的ic50为0.06μg/l，表明本发明抗体具有较高灵敏度；

21、（3）建立了可用于稻田水、豇豆、鸡肉样本中tap残留检测的 icelisa方法；在稻田水中检测tap的 lod为0.16μg/l，添加回收率介于90.2-114.6%，cv小于等于13.8%；在豇豆中检测tap的 lod为0.28μg/kg，添加回收率介于85.8-114.4%，cv小于等于18.6%；在鸡肉中检测tap的 lod为1.15μg/kg，添加回收率介于80.0-111.3%，cv小于等于17.9%；结果表明，本研究建立的icelisa方法具有较好的灵敏度、准确度和精密度，为多基质样本中tap的残留检测提供了有力的技术支撑。