一种PRRSVN蛋白单克隆抗体及其在猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断中的应用

本发明涉及生物材料，更具体的涉及一种prrsv n蛋白单克隆抗体及其在猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断中的应用。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs）该病主要感染妊娠母猪，临床表现为精神倦怠，罹患该病的母猪流产率达到30%，严重时可使母猪产出死胎。育肥猪感染后以呼吸道症状为主，会引起继发感染。仔猪感染后，主要在呼吸道出现病变，死亡率达到50%。猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，prrsv）在中国的猪群的进化过程中，发现基因出现大量的替换、插入和缺失。根据《中华人民共和国动物防疫法（2021修订版）》最新规定，该病已于2023年从国家一类动物疫病调整为二类疫病管理。prrsv具有高度变异性，且其免疫逃逸机制极为复杂，使该病毒的防控以及相关疫苗研发具有极大挑战。因此，迫切需要研发出高效稳定的诊断试剂。

2、prrsv是动脉炎病毒科、β-动脉炎属，其基因组为15 kb的单股正链线性rna结构。病毒核衣壳蛋白（n蛋白）由orf7基因编码，作为结构蛋白中进化保守性最强的组分，其c端α螺旋结构域包含核心抗原表位簇。n蛋白有较高的保守性并且含有最多的抗原决定簇，在猪和小鼠体内具有良好的免疫原性。n蛋白在prrsv感染早期，细胞内n蛋白浓度高，成为早期感染的血清学标记物。因而，n蛋白是prrsv免疫学诊断的重要靶标之一，并且在prrsv致病机制的研究中具有重要意义。n蛋白能干扰trim25介导的rig-i泛素化，prrsv n抑制宿主的先天免疫反应。

3、单克隆抗体（monoclonal antibody，mab），具有较高的特异性且能够精确识别特定抗原的表位，有助于开发基于表位的亚单位疫苗和相关的血清学检测方法。传统的杂交瘤细胞技术受限于通量较低和周期性长的问题，而噬菌体展示技术虽然筛选容量扩大，但存在抗体的重轻链会发生错配导致假阳性率高的缺陷。单克隆抗体是机体在受到抗原刺激之前，就已经分化出大量特异性针对不同抗原的b细胞。单克隆抗体是由单一的b淋巴细胞克隆所产生的抗体,它高度均一。目前单克隆抗体制备的技术有细胞融合技术，缺点是筛选出的抗体数量少且单一，筛选周期长。噬菌体展示技术缺点是工作量大，需要建库，库容有限且筛选过程复杂。

技术实现思路

1、本发明提供一种prrsv n蛋白单克隆抗体及其在猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断中的应用，用以解决现有技术中对prrsv的单克隆抗体筛选结果的稳定性和特异性不够理想的问题。

2、第一方面，本发明提供了一种prrsv n蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体为253、295、365、570或820单克隆抗体；其中，所述253单克隆抗体的重链可变区的cdr区的核苷酸序列如seq id no.1~seq id no.3所示，所述253单克隆抗体的轻链可变区的cdr区的核苷酸序列如seq id no.4~seq id no.6所示；所述295单克隆抗体的重链可变区的cdr区的核苷酸序列如seq id no.7~seq id no.9所示，所述295单克隆抗体的轻链可变区的cdr区的核苷酸序列如seq id no.10~seq id no.12所示；所述365单克隆抗体的重链可变区的cdr区的核苷酸序列如seq id no.13~seq id no.15所示，所述365单克隆抗体的轻链可变区的cdr区的核苷酸序列如seq id no.16~seq id no.18所示；所述570单克隆抗体的重链可变区的cdr区的核苷酸序列如seq id no.19~seq id no.21所示，所述570单克隆抗体的轻链可变区的cdr区的核苷酸序列如seq id no.22~seq id no.24所示；所述820单克隆抗体的重链可变区的cdr区的核苷酸序列如seq id no.25~seq id no.27所示，所述820单克隆抗体的轻链可变区的cdr区的核苷酸序列如seq id no.28~seq id no.30所示。

3、其中，seq id no.1~seq id no.30翻译的蛋白对应的氨基酸序列如seq id no.31~seq id no.60所示。

4、如上所述的prrsv n蛋白单克隆抗体，所述253单克隆抗体的重链的核苷酸序列如seq id no.61所示，所述253单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如seq id no.62所示；

5、所述295单克隆抗体的重链的核苷酸序列如seq id no.63所示，所述295单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如seq id no.64所示；

6、所述365单克隆抗体的重链的核苷酸序列如seq id no.65所示，所述365单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如seq id no.66所示；

7、所述570单克隆抗体的重链的核苷酸序列如seq id no.67所示，所述570单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如seq id no.68所示；

8、所述820单克隆抗体的重链的核苷酸序列如seq id no.69所示，所述820单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如seq id no.70所示。

9、如上所述的prrsv n蛋白单克隆抗体，所述570单克隆抗体通过包括以下步骤的制备方法得到：将prrsv n蛋白的基因构建入质粒后进行表达、纯化，得到重组n蛋白；将所述重组n蛋白、modifer试剂、quencher试剂和dr-b试剂以10:1:1:50的体积比混匀，离心取上清液重悬于sb试剂中，过膜分离出生物素化n蛋白；利用hypercell高通量单细胞筛选平台对与生物素化n蛋白结合的阳性b细胞进行筛选，获得单克隆抗体。

10、如上所述的prrsv n蛋白单克隆抗体，所述将prrsv n蛋白的基因构建入质粒，包括步骤：在prrsv n基因序列5′端添加sumo标签和3′端添加taa终止密码子，构建重组质粒pet-28a(+)-sumo-n。

11、如上所述的prrsv n蛋白单克隆抗体，所述表达的条件为：将构建后的重组质粒转化至大肠杆菌bl21感受态细胞中，培养至od600=0.7时，在25℃加入终浓度0.8 mmol/l的iptg诱导培养20 h。

12、如上所述的prrsv n蛋白单克隆抗体，所述纯化的方法为：使用镍柱进行纯化，150mmol/l咪唑洗涤杂蛋白，400 mmol/l咪唑洗脱目的蛋白。

13、如上所述的prrsv n蛋白单克隆抗体，所述利用hypercell高通量单细胞筛选平台对与生物素化n蛋白结合的阳性b细胞进行筛选，包括步骤：用releasable rapid spheres磁珠对cd138细胞进行富集，通过hypercell高通量单细胞筛选平台筛选阳性细胞，经10x单细胞测序，通过abfinder平台对序列进行亚型、重链峰度和重链分子标签综合评分，筛选出小鼠亚型为igg1亚型且综合评分大于6的序列。

14、第二方面，本发明提供了一种所述的prrsv n蛋白单克隆抗体在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒的诊断试剂中的应用。

15、如上所述的应用，所述试剂用于诊断猪繁殖与呼吸综合征。

16、n蛋白是组装prrsv病毒颗粒的重要结构蛋白。现有技术中有研究用大肠杆菌原核表达系统表达的prrsv n蛋白为包涵体表达。使用大肠杆菌原核表达系统表达的重组蛋白多为无活性包涵体，经过变复性操作易破坏蛋白空间构象，致其活性降低甚至丧失。构建质粒时加入融合标签有利于重组蛋白的可溶性表达。本发明通过优化密码子，在n基因序列5′端添加sumo标签和taa终止密码子，成功构建了重组质粒pet-28a(+)-sumo-n，利用sumo融合表达，蛋白在上清中表达。

17、本发明聚焦于prrsv的n蛋白，成功构建pet-28a(+)-sumo-n重组蛋白工程菌，通过诱导表达获得了可溶性目的蛋白，通过elisa结果验证过及经单个b细胞筛选、测序获得了重组抗体基因序列，进行真核细胞转染表达并筛选出5株单克隆抗体，为进一步探究prrsvn蛋白的结构特性和功能，并为prrsv致病机制和治疗等方面提供良好的技术支持及建立快速的prrsv n蛋白检测试剂盒奠定了坚实的基础。

18、基于单个b细胞的分选技术是突破传统技术瓶颈的关键策略。单个b细胞筛选技术具备高特异性、产量高和均一性好等优点。本发明用单个b细胞筛选技术，制备了针对prrsvn蛋白的单克隆抗体，为prrsv的诊断及n蛋白功能的相关研究奠定基础。

19、单个b细胞筛选技术筛选的序列其轻链和重链是天然配对且制备的单克隆抗体具有良好的稳定性和较高的特异性。现有技术中有研究采用荧光激活流式细胞技术（facs）分选b细胞，存在分离效率低、分离细胞种类有限、分选速度有限和易污染的问题。本发明用hypercell高通量单细胞筛选平台一次可筛选200000个细胞且是可视化筛选，能有效避免细胞污染。hypercell高通量单细胞筛选平台对筛选的序列进行重链峰度、重链分子标签和重链氨基酸高频突变的综合评分，更大程度上保证了抗体轻、重链可变区序列的完整性，以及单克隆抗体的特异性与稳定性。本发明制备出的prrsv n蛋白的单克隆抗体，其效价高达1:409600。相对现有技术中已制备的同类抗体效价更高。此外，本发明制备的570单克隆抗体亲和力kd=1.00×10-12m，相较于现有技术中的单克隆抗体，亲和力较高。