一种检测水稻纹枯病菌的检测试剂盒及应用

本发明属于病原微生物检测，具体涉及一种检测水稻纹枯病菌的检测试剂盒及应用。

背景技术：

1、水稻纹枯病（rice sheath blight）是由立枯丝核菌（

rhizoctonia solani）引起的由土壤传播的真菌病害。从秧苗期至穗期均可发生，以分蘖盛期至穗期受害最重，主要侵染叶鞘和叶片，严重时可侵染茎秆并蔓延至穗部。叶鞘发病时，自近水面处叶鞘开始岀现水渍状、暗绿色斑点，逐渐扩展成云纹状褐色病斑，后期病斑中部枯白色，潮湿时呈深灰色，边缘褐色至暗褐色，严重时病斑汇合成云纹状大斑块。病害严重时，延及叶片和稻穗，叶片病斑与叶鞘相似；而穗颈、穗轴、颖壳等部位则呈污绿色湿润状病斑，后变褐色，结实不良，半穗甚至全穗枯死。阴雨潮湿时，病部长岀白色至淡灰色、丝状霉状物，攀附于组织表面或相邻稻株之间，菌丝集结可形成白色绒球状菌丝团；最后形成暗褐色菜籽状菌核。严重时后期病斑表面及其附近还可产生白色粉状物，即病菌的担子和担孢子构成的子实层。

2、目前，针对上述病害的实验室鉴别主要采用病组织分离培养结合形态学观察，该方法操作周期长、易受环境杂菌污染干扰，且鉴定结果很大程度上依赖于鉴定人员对病原菌显微特征的熟悉程度，主观性较强。分子检测方面，常规pcr和实时荧光pcr技术虽然提高了检测的客观性和灵敏度，但其检测流程依赖变温热循环设备、凝胶电泳或荧光信号采集装置，在乡镇基层植保点难以常态化开展，导致病害确诊与田间显症之间存在较长时间差，容易错过最佳防控窗口期。

3、因此，开发高效、便捷的快速检测产品用于水稻健康检测，对于防控水稻纹枯病的传播有重要意义。

技术实现思路

1、为解决以上问题，本发明提供一种检测水稻纹枯病菌的检测试剂盒及应用。

2、本发明是通过如下技术方案实现的：

3、一种检测水稻纹枯病菌的检测试剂盒，包括恒温扩增试剂、crispr/cas12b试剂以及aunp比色试剂，所述crispr/cas12b试剂包括cas12b蛋白和报告探针，所述aunp比色试剂包括氯化钠溶液。

4、所述恒温扩增试剂包括用于扩增立枯丝核菌

rsphm基因的引物对；所述引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、所述crispr/cas12b试剂还包括sgrna；所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.6所示。

6、所述aunp比色试剂还包括dna1功能化aunp试剂和dna2功能化aunp试剂；所述dna1的核苷酸序列如seq id no.8所示；dna2的核苷酸序列如seq id no.9所示。

7、优选地，所述dna1功能化aunp试剂和dna2功能化aunp试剂的制备方法分别包括以下步骤：

8、将dna1或dna2分别与三(2-羧乙基)膦溶液等体积混合进行巯基dna还原反应，得到还原后的dna1或dna2。

9、取还原后的dna1或dna2，与aunp水溶液混合，得到dna1修饰的aunp或dna2修饰的aunp。

10、向dna1修饰的aunp或dna2修饰的aunp中加入磷酸盐缓冲液进行老化后，用磷酸缓冲液重悬，得到dna1功能化aunp试剂和dna2功能化aunp试剂。

11、优选地，所述dna1或dna2的浓度为100μm；所述三(2-羧乙基)膦的浓度为10mm。

12、所述的检测试剂盒在可视化检测水稻纹枯病菌中的应用。

13、优选地，所述水稻纹枯病菌为立枯丝核菌（

rhizoctonia solani）。

14、优选地，具体应用方法包括以下步骤：

15、获取待测样本的基因组dna。

16、以所述基因组dna为模板，利用所述引物对进行rpa扩增反应，获得扩增产物。

17、将扩增产物与所述的crispr/cas12b试剂混合，进行酶切反应，获得反应产物。

18、向反应产物中加入所述的aunp比色试剂，进行比色反应后，读取显色结果：若颜色为红色，代表检测样本中存在水稻立枯丝核菌；若颜色为紫色，则代表检测样本不含有水稻立枯丝核菌。

19、优选地，所述rpa扩增反应的温度为37℃~41℃，时间为15min~25min。

20、优选地，所述酶切反应的温度为40℃~50℃，时间为25min~35min。

21、优选地，所述比色反应的温度为25℃~30℃，时间为2min~4min。

22、与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：

23、本发明提供一种检测水稻纹枯病菌的检测试剂盒，包括恒温扩增试剂、crispr/cas12b试剂以及aunp比色试剂，所述crispr/cas12b试剂包括cas12b蛋白和报告探针，所述aunp比色试剂包括氯化钠溶液。

24、所述恒温扩增试剂包括用于扩增立枯丝核菌

rsphm基因的引物对；所述引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。

25、所述crispr/cas12b试剂还包括sgrna；所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.6所示。

26、所述aunp比色试剂还包括dna1功能化aunp试剂和dna2功能化aunp试剂；所述dna1的核苷酸序列如seq id no.8所示；dna2的核苷酸序列如seq id no.9所示。

27、本发明提供试剂盒具有以下优点：检测灵敏度高，可检测低至纳克（ng）级病原菌浓度，特异性强，能精准识别真菌目标序列，降低假阳性风险。无需复杂设备，反应时间短，适合现场快速检测。结合荧光信号或aunp比色直接读取结果，便捷高效。

28、本发明提供的试剂盒能够快速且准确地诊断水稻是否受到纹枯病菌的感染，有助于有效防治水稻纹枯病，降低经济损失，该检测过程无需加热循环仪器即可完成，为实现

r.

solani的现场快速检测，将检测成本控制在20元以内，而免疫试纸条的成本在40元左右。

1.一种检测水稻纹枯病菌的检测试剂盒，包括恒温扩增试剂、crispr/cas12b试剂以及aunp比色试剂，所述crispr/cas12b试剂包括cas12b蛋白和报告探针，所述aunp比色试剂包括氯化钠溶液，其特征在于，

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述dna1功能化aunp试剂和dna2功能化aunp试剂的制备方法分别包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述dna1或dna2的浓度为100μm；所述三(2-羧乙基)膦的浓度为10mm。

4.一种权利要求1所述的检测试剂盒在可视化检测水稻纹枯病菌中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水稻纹枯病菌为立枯丝核菌（rhizoctonia solani）。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，具体应用方法包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述rpa扩增反应的温度为37℃~42℃，时间为10min~30min。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酶切反应的温度为40℃~50℃，时间为25min~35min。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述比色反应的温度为25℃~30℃，时间为2min~4min。