突变体β-1,3-葡聚糖酶及其应用以及真菌检测试剂盒

本技术涉及真菌检测，尤其涉及一种突变体β-1,3-葡聚糖酶及其应用以及真菌检测试剂盒。

背景技术：

1、真菌感染构成了日益严峻的全球健康问题，影响人类和动物健康，并带来沉重的临床和经济负担。在人类医学中，由念珠菌属、曲霉属和隐球菌属等物种引起的机会性系统性真菌病是免疫缺陷患者发病和死亡的主要原因。在兽医领域，真菌性疾病的影响同样重大，范围从大型动物的侵袭性真菌病到伴侣动物中高度流行的浅表性皮肤癣菌病。诸如

microsporum canis（犬小孢子菌）和

trichophyton mentagrophytes（须癣毛癣菌）等皮肤癣菌仍然是犬猫皮肤感染的主要原因。

2、目前真菌感染的诊断仍严重依赖培养和镜检，然而这些技术较为耗时且依赖于操作者经验，且常因灵敏度低或结果不明确而受限，这一技术缺陷在动物临床实践中尤其突出，快速准确的检测对于指导抗真菌治疗和避免不必要的用药至关重要。

3、真菌细胞壁作为一种动态的多层结构，为诊断靶向提供了独特的机会。在其主要组分中，β-1,3-d-葡聚糖和β-1,6-d-葡聚糖是最主要的也是最关键的结构多糖，对维持真菌完整性和致病性起着重要作用（bowman&free, 2006; gow et al., 2017）。这些葡聚糖也作为病原体相关分子模式，触发宿主免疫识别。目前的商业化检测方法主要使用抗体检测β-1,3-d-葡聚糖，并已在人类医学系统性真菌病的诊断中展现出临床价值（obayashi etal., 1995; pazos et al., 2005）。然而，不同真菌物种、形态类型及生长条件会导致细胞壁中葡聚糖的组成与暴露程度存在显著差异，使得单一靶标的检测方法难以全面覆盖所有病原真菌。此外，一些植物（如燕麦、大麦和黑麦）也含有由β-1,3-d-葡聚糖与β-1,4-葡聚糖组成的线性β-葡聚糖链，若仅以β-1,3-d-葡聚糖作为检测靶点，可能因植物来源的干扰而造成误诊。

4、蛋白质工程学的进展现在允许通过定点诱变，将水解酶重新设计成高特异性的结合探针。例如，gh76家族β-1,6-葡聚糖酶neg1通过其催化残基突变（e321q）已被转化为催化失活但具有高亲和力的β-1,6-葡聚糖探针（yamanaka et al., 2020）。同样，本技术发现热稳定性β-1,3-葡聚糖酶也可以被工程化改造用于选择性结合β-1,3-葡聚糖。然而，此前尚无诊断平台能将β-1,3-和β-1,6-葡聚糖识别整合于单一检测格式中。

5、本技术中，提供了一种基于工程化催化失活型葡聚糖酶的双靶向夹心elisa的开发：其一是源自超嗜热古菌

pyrococcus furiosus的gh16家族β-1,3-葡聚糖酶lama的e175位点的突变体，其二是β-1,6-葡聚糖特异性探针neg1-e321q。本技术发现双靶向夹心法优于单靶点（β-1,3-葡聚糖或β-1,6-葡聚糖）的检测灵敏度。本技术优化了检测流程，使用参考真菌菌株（

saccharomyces cerevisiae、

candida albicans、皮肤癣菌和

alternariaspp.）验证了其性能，并进一步通过兽医临床样本评估了其适用性。通过搭建连接动物和人类健康的真菌诊断桥梁，这种双识别策略提供了一个多功能平台，预计将对兽医皮肤病学、更广泛的医学真菌学以及真菌血症检测领域产生潜在影响。

技术实现思路

1、有鉴于此，本技术的目的在于提供一种突变体β-1,3-葡聚糖酶，使其能够高效、准确、灵敏的检测真菌，特别是与突变体β-1,6-葡聚糖酶neg1-e321q联用；

2、本技术的另外一个目的在于提供一种基于上述突变体β-1,3-葡聚糖酶的组合探针，使得所述组合探针能够显著提高真菌检测的灵敏度；

3、本技术的另外一个目的在于提供上述突变体β-1,3-葡聚糖酶和组合探针在制备真菌检测试剂盒中的相关应用；

4、本技术另外一个目的在于提供一种基于上述组合探针的真菌检测试剂盒和非诊断性检测真菌的方法。

5、为了解决上述技术问题/达到上述目的或者至少部分地解决上述技术问题/达到上述目的，作为本技术的第一个方面，提供了一种突变体β-1,3-葡聚糖酶，该酶的序列包括在野生型β-1,3-葡聚糖酶lama的全长或截短的氨基酸序列基础上进行lama全长第170位氨基酸和/或第175位氨基酸突变的突变体序列，所述lama全长第170位氨基酸突变和第175位氨基酸突变分别独立选自将原有氨基酸e突变为除氨基酸d之外的其他任意一种基本氨基酸的突变。

6、所述lama全长第170位氨基酸突变和第175位氨基酸突变选自将原有氨基酸e突变为氨基酸q。

7、作为本技术的第二个方面，提供了一种组合探针，包括本技术所述的突变体β-1,3-葡聚糖酶，以及突变体β-1,6-葡聚糖酶；所述突变体β-1,6-葡聚糖酶的序列包括在野生型β-1,6-葡聚糖酶neg1的全长或截短的氨基酸序列基础上进行neg1全长第321位氨基酸突变的突变体序列，所述neg1全长第321位氨基酸突变将原有氨基酸e突变为氨基酸q。

8、作为本技术的第三个方面，提供了本技术所述的突变体β-1,3-葡聚糖酶或本技术所述的组合探针在制备真菌检测试剂盒中或在非诊断性检测真菌中的应用。

9、作为本技术的第四个方面，提供了一种真菌检测试剂盒，包括本技术所述的组合探针。

10、可选地，所述试剂盒为elisa试剂盒，包括包被有突变体β-1,3-葡聚糖酶的固相载体和报告酶标记的突变体β-1,6-葡聚糖酶；或者包括包被有突变体β-1,6-葡聚糖酶的固相载体和报告酶标记的突变体β-1,3-葡聚糖酶。

11、进一步可选地，还包括如下成分的一种或多种：

12、报告酶底物、洗涤液、终止液、封闭液、缓冲液、阴性对照样本。

13、可选地，所述试剂盒为免疫层析试纸条，包括结合垫和nc膜，所述结合垫包被有金标的突变体β-1,3-葡聚糖酶；所述nc膜包括检测线和质控线，所述检测线标记有突变体β-1,6-葡聚糖酶，所述质控线标记有抗金标的突变体β-1,3-葡聚糖酶的抗体；

14、或者，包括结合垫和nc膜，所述结合垫包被有金标的突变体β-1,6-葡聚糖酶；所述nc膜包括检测线和质控线，所述检测线标记有突变体β-1,3-葡聚糖酶，所述质控线标记有抗金标的突变体β-1,6-葡聚糖酶的抗体。

15、进一步可选地，所述金标的突变体β-1,3-葡聚糖酶或金标的突变体β-1,6-葡聚糖酶修饰有小肽段标签，所述抗金标的突变体β-1,3-葡聚糖酶的抗体和抗金标的突变体β-1,6-葡聚糖酶的抗体包括抗所述小肽段标签的抗体。

16、作为本技术的第五个方面，提供了一种非诊断性检测真菌的方法，包括：

17、对待测样本进行预处理；

18、将预处理后的待测样本与突变体β-1,3-葡聚糖酶或突变体β-1,6-葡聚糖酶在反应体系中孵育；

19、向反应体系中加入报告酶标记的β-1,6-葡聚糖酶或报告酶标记的突变体β-1,3-葡聚糖酶孵育反应；

20、向反应体系中加入报告酶对应的显色底物，通过吸光度检测设备测定待测样本的od值；

21、按照上述方法对多个阴性对照样本进行检测，以所述多个阴性对照样本od值的平均值的3倍标准差作为阳性阈值；

22、根据所述待测样本的od值和阳性阈值，判断待测样本是否含有真菌。

23、可选地，所述预处理包括对待测样本进行碱性处理，同时至少加热5min。

24、本技术通过使用经过工程化改造的催化失活型突变体葡聚糖酶，同时检测真菌细胞壁的两种主要结构组分-β-1,3-d-葡聚糖和β-1,6-d-葡聚糖。所述突变体葡聚糖酶包括源自超嗜热古菌的gh16家族β-1,3-葡聚糖酶的突变体lama，以及来自gh76家族的β-1,6-葡聚糖酶的突变体neg1作为特异性探针，通过对酿酒酵母、白色念珠菌、兽医病原皮肤癣菌和非皮肤癣菌链格孢菌进行评估检测，结果证实该突变体葡聚糖酶识别系统通过同时靶向β-1,3-和β-1,6-葡聚糖表位，为真菌检测提供了一个特异性强、效果好的平台，在真菌诊断中具有广谱适用性。