NdSTS蛋白在催化法尼基焦磷酸合成罗汉柏烯中的应用的制作方法

本发明属于生物化学，尤其涉及ndsts蛋白在催化法尼基焦磷酸合成罗汉柏烯中的应用。

背景技术：

1、罗汉柏烯（(+)-thujopsene，cas：82262-80-4）是一种具有3/6/6三环骨架结构的天然倍半萜化合物，也是一种极其重要的单体香料，不仅可直接用于高级香水与日化香精的配方中，还具备抗菌、杀白蚁和抗肿瘤等多种显著的生物活性。更为重要的是，罗汉柏烯作为一种关键的合成前体，可进一步被氧化转化为多种具有极高附加值的衍生物，例如珍贵香料3-thujopsanone（ cas:25966-79-4），常用于木质、龙涎香型配方以及皮革和烟草制品的制备），以及杀虫、抑菌活性更强的mayurone（cas: 4677-90-1）、thujopsan-2α-one（cas:78392-83-3）等化合物。

2、目前，工业上获取罗汉柏烯的途径主要依赖于传统的植物提取法。然而，这种依靠自然植物富集的提取方式存在提取效率低、生长周期长、植物资源消耗大等固有缺陷，难以满足日益增长的全球市场需求。随着合成生物学的飞速发展，利用微生物发酵与酶催化技术直接合成目标高价值萜类化合物成为了当前最为高效、绿色的发展趋势。

3、但是，实现罗汉柏烯微生物大规模发酵生产的先决条件是获取能高效催化其合成的特异性酶（倍半萜合酶）。尽管罗汉柏烯早在数十年前就被发现，但迄今为止，业界尚未证实并克隆出能特异性催化生物合成该物质的植物源倍半萜合酶；而在微生物源方面，当前仅报道过一种源自链霉菌属细菌的倍半萜合酶具备相应催化活性。可用的生物酶资源极度匮乏，且现有已知酶的序列来源单一，严重制约了罗汉柏烯及其衍生物工业化生物制造的进程。因此，从更为广泛的自然界生物宝库中发掘、鉴定出结构全新、具有催化合成罗汉柏烯活性的新型倍半萜合酶，是目前香料合成与生物工程领域亟待解决的重要技术难题。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提出ndsts蛋白在催化法尼基焦磷酸合成罗汉柏烯中的应用。

2、本发明的技术方案为：

3、一种蛋白质在制备罗汉柏烯及其衍生物中的应用，所述蛋白质包含如seq idno.2所示的序列，所述罗汉柏烯衍生物为ent-thujopsan-2β-ol。

4、进一步地，所述蛋白质作为催化剂，催化底物法尼基焦磷酸制备罗汉柏烯。

5、进一步地，编码所述蛋白质的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、一种体外制备罗汉柏烯及其衍生物的方法，包括以下步骤：将包含如seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白质与底物法尼基焦磷酸接触并进行酶促反应，生成罗汉柏烯及其衍生物。

7、进一步地，所述体外制备的反应体系还包含mg2+和ph为7.3-7.8的tris-hclbuffer，所述酶促反应温度为25-30℃。

8、一种重组表达载体，所述重组表达载体内连接有seq id no.1所示序列，所述重组表达载体为含有启动子adh2p的pyeu载体。

9、一种制备罗汉柏烯及其衍生物的体内发酵方法，包括以下步骤：向酿酒酵母内导入所述重组表达载体后，发酵培养，得到发酵产物罗汉柏烯及其衍生物。

10、进一步地，所述发酵培养的培养液包括碳源和氮源，所述碳源为葡萄糖；所述发酵培养的温度为25-28℃。

11、与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

12、本发明涉及ndsts蛋白在催化法尼基焦磷酸合成罗汉柏烯中的应用，所述新型倍半萜合酶基因ndsts从真菌nemania diffusa中克隆得到，与细菌来源的tac28_6116合酶序列相似性仅为12%，是一种新的罗汉柏烯合成酶。实验结果证实：ndsts蛋白不仅能够在体外体系中直接催化底物法尼基焦磷酸（fpp）同步生成高价值香料罗汉柏烯及其衍生物ent-thujopsan-2β-ol；将其基因导入酿酒酵母后，重组酵母菌株也能利用自身内源合成的fpp，通过常规发酵直接产出目标产物。克服了传统植物提取法效率低下的缺陷，丰富了罗汉柏烯生物合成的靶标酶资源，为利用微生物发酵技术实现复杂香料的大规模、低成本绿色制造开辟新渠道，具备极高的工业化应用前景。

1.一种蛋白质在制备罗汉柏烯及其衍生物中的应用，其特征在于，所述蛋白质包含如seq id no.2所示的序列，所述罗汉柏烯衍生物为ent-thujopsan-2β-ol。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质作为催化剂，催化底物法尼基焦磷酸制备罗汉柏烯。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述蛋白质的核苷酸序列如seq idno.1所示。

4.一种体外制备罗汉柏烯及其衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：将包含如seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白质与底物法尼基焦磷酸接触并进行酶促反应，生成罗汉柏烯及其衍生物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述体外制备的反应体系还包含mg2+和ph为7.3-7.8的tris-hcl buffer，所述酶促反应温度为25-30℃。

6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体内连接有seq id no.1所示序列，所述重组表达载体为含有启动子adh2p的pyeu载体。

7.一种制备罗汉柏烯及其衍生物的体内发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：向酿酒酵母内导入权利要求6中所述的重组表达载体后，发酵培养，得到发酵产物罗汉柏烯及其衍生物。

8.根据权利要求7所述的体内发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的培养液包括碳源和氮源，所述碳源为葡萄糖；所述发酵培养的温度为25-28℃。