一种细胞转运蛋白HSFtsp的制备方法和在降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和链格孢酚中的应用

本发明属于酶工程，涉及一种细胞转运蛋白及其应用。

背景技术：

1、霉菌毒素（mycotoxins）是由真菌产生的一类次生代谢产物，可污染农作物、水果、食品及动物饲料等多种农业产品。据估计，全球约有25%的农产品受到霉菌毒素污染，对食品安全以及人类和动物健康造成了严重威胁。其中，黄曲霉毒素b1（aflatoxin b1，afb1）主要由黄曲霉（aspergillus flavus）和寄生曲霉（aspergillus parasiticus）产生，是目前已知毒性最强的天然产生霉菌毒素之一，具有显著的肝毒性、致突变性、致癌性以及免疫抑制作用。国际癌症研究机构（international agency for research on cancer，iarc）已将afb1列为ⅰ类致癌物。玉米赤霉烯酮（zearalenone，zen）主要由镰刀菌属（fusarium spp.）产生，广泛污染玉米、小麦等谷物及其加工产品。由于zen具有较强的雌激素样活性，可导致动物生殖系统紊乱和内分泌功能异常。与此同时，随着分析检测技术的不断发展，一些过去未被充分关注的“新兴霉菌毒素”（emerging mycotoxins）逐渐受到研究者的广泛关注，其中链格孢毒素（alternaria toxins）是具有代表性的一类。交链孢酚（alternariol，aoh）是由链格孢属（alternaria spp.）产生的一种重要二苯并-α-吡喃酮类（dibenzo-α-pyrone）次生代谢产物，广泛存在于谷物、水果及其加工制品中，并与细胞毒性、遗传毒性以及潜在的致癌风险和慢性健康危害相关。因此，aoh已成为霉菌毒素研究领域中新兴的重要研究对象。

2、在实际生产过程中，食品和饲料中的霉菌毒素污染通常并非单一存在，多种毒素共同污染及其联合暴露可能产生拮抗效应、加和效应或协同效应，从而导致更加严重的潜在健康风险。例如，黄曲霉毒素（aflatoxins，afs）与其他具有致癌性的霉菌毒素联合暴露可能诱导复合毒性效应；已有研究表明，afb1和zen共同暴露可产生协同细胞毒性作用。zhou等研究发现，afb1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，don）和zen单独暴露、二元组合暴露以及三元组合暴露均可在hepg2细胞和raw 264.7细胞中诱导不同的毒性响应，表明多种霉菌毒素联合暴露可能产生复杂的复合毒性效应。鉴于afb1、zen和aoh在产生菌来源、化学结构以及毒理作用机制等方面存在显著差异，三者在食品和饲料中的共同存在进一步增加了霉菌毒素风险防控的复杂性。因此，开发针对多种霉菌毒素复合污染的高效脱毒策略具有重要意义和迫切需求。

3、目前，人们已开发出多种方法用于脱毒或去除被霉菌毒素污染的产品，包括物理方法（如吸附、热处理）、化学方法（如氧化、碱处理）以及利用微生物或酶的生物方法。近年来，生物脱毒技术因其环境友好，特异性强等优势，成为研究热点。然而现有酶解技术体系仍存在诸多结构性缺陷，难以满足实际生产需求，首要问题是降解谱狭窄，目前已鉴定的霉菌毒素降解酶中，绝大多数仅能针对单一毒素发挥作用，如专利202311691221.3中公开了一种zen降解酶，对单一真菌毒素zen具有较强的降解能力，无法应用于多毒素共污染的环境中。少数研究报道了可同时降解两种毒素的酶类，也普遍存在活性偏低、反应条件苛刻等问题，难以实现工业化应用。因此，寻找和鉴定新的能够同时降解多种真菌毒素的降解酶至关重要。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出一种细胞转运蛋白hsftsp的制备方法和在降解黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮和链格孢酚中的应用。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明研究的细胞转运蛋白（cellular transport proteins）是一类广泛存在于细胞膜或细胞内膜系统中的功能性蛋白，能够通过特异性识别和结合底物，实现离子、小分子物质、代谢产物及外源化合物在细胞内外或细胞器之间的选择性运输与调控。根据其作用机制，细胞转运蛋白主要包括通道蛋白、载体蛋白和atp驱动型转运蛋白等类型，在维持细胞稳态、物质交换、能量代谢及环境适应过程中发挥关键作用。其中，部分转运蛋白能够参与有害物质的识别、跨膜转运和细胞解毒过程，通过调控污染物、生物活性分子及代谢中间体的分布影响细胞响应能力。因此，细胞转运蛋白不仅是维持生命活动的重要功能组分，也因其在物质递送、生物催化调控、环境适应及生物工程应用中的潜在价值而受到广泛关注。近年来，随着结构生物学、基因工程和合成生物学的发展，具有特定底物识别能力和高效转运能力的新型转运蛋白不断被发现，为构建高效生物转化体系和开发绿色生物技术提供了新的理论基础和应用方向。

4、本发明第一方面，提供了一种密码子优化的编码细胞转运蛋白hsftsp的核苷酸片段，所述细胞转运蛋白hsftsp的氨基酸序列如seq id no.1所示。进一步的，所述核苷酸片段的序列如seq id no.3所示。

5、第二方面，提供了含有上述的核苷酸片段的重组质粒。

6、第三方面，提供了一种重组菌株，包含上述的重组质粒。

7、第四方面，提供了一种制备细胞转运蛋白hsftsp的方法，步骤为：将上述重组质粒或重组菌株诱导表达、纯化获得细胞转运蛋白hsftsp。

8、第四方面，提供了细胞转运蛋白hsftsp在农作物脱毒中的应用。所述脱毒为脱除黄曲霉毒素 b1、玉米赤霉烯酮和链格孢酚中的一种或多种。脱除黄曲霉毒素 b1的降解产物为afq1或epi-afq1，脱除玉米赤烯酮的降解产物为15-oh-zen，脱除链格孢酚的降解产物是10-oh-aoh。优选的，上述农作物为花生、玉米和小麦中的任一种。上述细胞转运蛋白hsftsp的使用浓度为50-100 μg/ml。

9、优选的，上述应用的温度为20-80℃，ph为4.0-10.0。

10、具体来说，在ph 7.0，温度40℃，酶添加量为10 μg的最适条件下，在24 h时对afb1的降解率达到99.16%，且在40-80℃范围内保持80%以上的降解率。

11、在ph 8.0，温度60℃，酶添加量为20 μg的最适条件下，在24 h时对zen的降解率达到95.12%，且在50-80℃范围内保持80%以上的降解率。

12、在ph 8.0，温度60℃，酶添加量为20 μg的最适条件下，在24 h时对aoh的降解率达到94.72%，且在40-60℃范围内保持70%以上的降解率。

13、本发明具有以下有益效果：

14、1、本发明提供了一种能够同时降解afb1、zen和aoh的细胞转运蛋白hsftsp，在ph7.0，温度40℃，酶添加量为10 μg的最适条件下，在24 h时对afb1的降解率达到99.16%，且在40-80℃范围内保持80%以上的降解率；在ph 8.0，温度60℃，酶添加量为20 μg的最适条件下，在24 h时对zen的降解率达到95.12%，且在50-80℃范围内保持80%以上的降解率；在ph 8.0，温度60℃，酶添加量为20 μg的最适条件下，在24h对aoh的降解率达到94.72%，且在40-60℃范围内保持70%以上的降解率。

15、2、本发明的细胞转运蛋白hsftsp是一种可以耐受一定程度高温的真菌毒素降解酶。afb1降解产物的分子式为c17h12o7，zen降解产物分子式为c18h22o6，aoh降解产物分子式为c14h10o6 。结合afb1、zen和aoh的结构可知三种毒素降解产物分别为afq1/epi-afq1、15-oh-zen、10-oh-aoh。本技术通过向受污染的花生粉、玉米粉和小麦粉样品中加入100 μg/ml的hsftsp，于50℃、150 rpm振荡条件下孵育24 h，对afb1、zen和aoh的降解率分别为72.0%、84.0%和76.5%。同时，斑马鱼实验结果进一步证明，hsftsp对afb1、zen和aoh的降解产物均无明显毒性。本技术为在食品或饲料中afb1、zen和aoh的脱毒提供了新的候选物，具有较好的应用前景。