一种提高花粉耐热性的方法

本发明属于农业生物，涉及一种提高花粉耐热性的方法，具体涉及一种通过抑制玉米基因aldh3(基因号zm00001eb160820)表达来提高玉米花粉耐热性的方法。

背景技术：

1、玉米(zea mays)是我国第一大粮食作物，产量占比高，其产量对于保证国家粮食安全具有重要意义。我国玉米种植范围广，主产区包括北方产区(约占40％)、黄淮海产区(约占35％)及西南山地产区(约占18％)。中国高温热害集中出现在5～9月，频发于7～8月，而黄淮海地区夏玉米的生长发育期，尤其是生育期(6～9月)，与高温热害的发生时间高度重合。而相比与营养生长阶段，玉米花药生殖发育阶段对热胁迫更加敏感。高温胁迫损害玉米的生殖发育，导致花粉发育异常，花粉活力和育性下降，最终使结实率下降。近年来，受全球气候变化的影响，高温热害发生的频率越来越高，给玉米的生产带来了严重的危害。高温导致我国玉米每年减产10％以上，其中一个重要原因是高温导致花粉育性和活力下降。因此，发掘和利用玉米花药或花粉中的耐热基因对提高热胁迫下花粉育性和减少高温下玉米产量损失具有重要意义。然而，目前关于玉米花药生殖发育期热胁迫响应的调控机制仍然是不清楚的，挖掘的且被育种利用的玉米耐热基因依然十分稀少，极大地限制了玉米耐热分子育种进程。

2、玉米属于喜温作物，本身能够耐受一定程度的高温，且花药的生殖发育过程较为敏感，易受到不同环境因素的影响，因而利用传统的育种方式选育玉米耐热品种周期长、难度大、成本高。利用rna-seq鉴定热胁迫应答基因是发掘耐热基因的一种重要手段，然而传统rna-seq往往使用组织或器官作为实验材料，掩盖细胞之间的异质性，导致细胞类型特异的热胁迫应答基因不能被准确鉴定出来。本课题组前期通过单细胞转录组测序从玉米花药中鉴定到一个参与调控玉米花药热胁迫响应的基因prp2(基因号zm00001eb080380)，参见专利文件cn2025103642272。prp2在花药表皮层细胞特异响应热胁迫，突变prp2后能够显著提高花粉的耐热性。

技术实现思路

1、在最近的玉米耐热胁迫响应基因研究中，本课题组又鉴定到一个在花药药室内壁(endothecium)细胞中特异表达的aldh3基因(基因id号zm00001eb160820)也参与了花药热胁迫应答。aldh3是乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，aldh)家族的成员之一，负责催化醛氧化成羧酸，通过限制醛的积累和氧化应激，参与植物的解毒过程，提高植物胁迫耐受能力(kirch h,bartels d,wei y,et al.the aldh gene superfamily ofarabidopsis.trends in plant science,2004(9):371-377.)。在正常条件下，aldh3失活突变体的花粉育性不受影响，但在高温条件下aldh3突变体的花粉育性明显比野生型高，且不会对其他性状造成影响，aldh3在玉米耐热品种改良中具有潜在的应用价值。实验发现，通过抑制aldh3的表达可以提高玉米花粉的耐热性。具体而言，本发明包括如下技术方案。

2、本发明的第一个方面提供了一种提高花粉耐热性的方法，其特征在于，通过抑制植物中aldh3基因的表达来增强植物花粉的耐热性，其中所述aldh3是在花药药室内壁(endothecium)细胞中特异表达的乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，aldh)成员。

3、优选地，所述植物是农作物，包括但不限于水稻、小麦、玉米、大豆、大麦、燕麦、黑麦、高粱、棉花、蔬菜、十字花科植物等，例如所述植物是禾本科农作物，选自小麦、水稻、玉米、大豆、大麦、燕麦、谷子、黑麦和高粱，更优选所述植物是玉米。

4、在一种实施方式中，上述植物是玉米，选自现有的野生种、自交系、农家种和杂交种，其中玉米b73来源的蛋白aldh3的氨基酸序列如seq id no:1所示(基因号zm00001eb160820)，编码基因aldh3的编码区即cds核苷酸序列如seq id no:2所示。

5、matangsskgpfevpkvevrftklfidgkfvdavsgktfetrdprtgeviasiaeggkadvdlavkaareafdngpwprmtgyergrilhrfadlidehveelaaldtvdagklfavgkardipgaahllryyagaadkvhgatlkmaqrmhgytlkepvgvvghivpwnypttmfffkvgpalaagcavvvkpaeqtplsalfyahlareagvpagvlnvvpgfgptagaavaahmdvdkvsftgstevgrlvmraaaesnlkpvslelggkspvivfddadldmavnlvnfatytnkgeicvagtriyvqegiydefvkkaaelasksvvgdpfnpsvsqgpqvdkdqyekvlryidigkregatlvtggkpcgdkgyyieptiftdvkddmtiaqdeifgpvmalmkfktveeviqkanntryglaagivtknidvantvsrsiragaiwincyfafdpdapfggykmsgfgkdmgmdaldkylqtktvvtplyntpwl(seq id no:1)。

6、作为一种应用方式中，上述基因aldh3(基因号zm00001eb160820)可作为一种基因资源用于培育耐高温玉米品种。

7、可选地，上述基因aldh3的抑制是指基因aldh3的表达下调、失活、功能减弱或敲除。

8、进一步地，上述玉米的品种包括但不限于玉米品种b73、kn5585、郑958、昌72、mo17等。

9、在一种实施方式中，可以通过下述方式实施基因aldh3抑制：

10、(1)敲除植物染色体中基因aldh3；

11、(2)下调植物染色体中基因aldh3的表达水平；

12、(3)用编码功能丧失或下调的基因aldh3突变体替代植物染色体中基因aldh3；和/或

13、(4)阻断或干扰植物染色体中基因aldh3的表达；

14、(5)通过ems诱变造成基因aldh3失活。

15、上述方法中，方式(2)可以选自下组：

16、(2-1)对基因aldh3启动子区和/或编码区进行突变导致基因aldh3的表达水平下调；

17、(2-2)对基因aldh3上游调控因子进行突变导致基因aldh3的表达水平下调；或者

18、(2-3)在植物中导入蛋白aldh3的互作蛋白来改变基因aldh3的功能。

19、上述方法中，方式(3)可以选自下组：

20、(3-1)编码区发生碱基突变，导致编码的蛋白aldh3功能丧失；

21、(3-2)编码区进行移码突变，导致编码的蛋白aldh3功能丧失。

22、例如，当所述植物是玉米时，方式(3-1)可以是通过使玉米基因aldh3编码区即cds核苷酸序列seq id no:2第507位碱基g突变为a导致aldh3基因失活，即编码蛋白aldh3的第169个氨基酸trp(色氨酸，w)的密码子由tgg突变为tga，导致翻译提前终止。

23、可选地，所述基因aldh3的抑制通过基因编辑技术、反义核酸、转录调控实施。

24、例如，所述基因编辑技术可以选自下组：同源双交换，talen系统，crispr-cas9系统，crispr-cpf1系统，crispr-cas12系统，crispr-best系统，mugent。

25、本发明的第二个方面提供了一种鉴定玉米花粉耐热性的玉米品种的方法，包括下述步骤：

26、提取玉米基因组dna，对玉米的基因aldh3进行测序；和/或

27、测定所述玉米细胞表达的蛋白中是否含有氨基酸序列如seq id no:1所示的多肽，

28、当检测结果表明玉米基因组中对应基因aldh3的编码区即cds核苷酸序列不是seqid no:2、并且/或者玉米细胞表达的蛋白中不含氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白aldh3时，提示玉米具有花粉耐热胁迫抗性高的趋势，将该玉米品种作为具有花粉耐热性的候选品种。

29、在一种实施方式中，当对玉米的基因aldh3进行测序时，可以使用下述引物对进行pcr扩增反应，

30、正向引物zmaldh3-emsf：cacgcttgtttcccgcag(seq id no:3)，

31、反向引物zmaldh3-emsr：aatcccggcacgacgttga(seq id no:4)。

32、优选地，上述pcr扩增是pcr mix方法。

33、使用该引物对zmaldh3-emsf和zmaldh3-emsr对玉米b73基因组进行pcr扩增，得到的pcr片段的核苷酸序列如seq id no:5所示：

34、cacgcttgtttcccgcaggagcgtggtcggatcctccacaggttcgcggacctgatcgacgagcacgtggaggagctggcggcgctggacacggtggacgccggcaagctgttcgccgtgggcaaggcgcgggacatcccgggcgccgcgcacctgctgcgctactacgccggcgccgccgacaaggtgcacggcgcgacgctcaagatggcgcagcggatgcacgggtacacgctcaaggagcccgtgggcgtggtgggccacatcgtgccctggaactaccccaccaccatgttcttcttcaaggtagggcccgcgctcgccgcaggctgcgccgtcgtcgtcaagcccgccgagcagacgccgctgtccgcgctcttctacgcgcacctcgccagggaggccggcgtccccgccggcgtgctcaacgtcgtgccgggatt(seqid no:5)。

35、相应地，本发明的第三个方面提供了一种用于实施上述鉴定方法的试剂盒，其包括用于扩增基因aldh3的下述pcr引物对：

36、正向引物zmaldh3-emsf：cacgcttgtttcccgcag(seq id no:3)，

37、反向引物zmaldh3-emsr：aatcccggcacgacgttga(seq id no:4)。

38、所述试剂盒还可以进一步包括用于从玉米植株组织例如叶片或者籽粒中提取总rna或dna的核酸提取系统，和/或反转录成cdna的反转录系统。

39、进一步地，上述试剂盒还包括使用说明书，所述说明书记载有提取植物rna或dna的操作步骤、检测核苷酸序列如seq id no:2所示基因aldh3的步骤和鉴定标准。

40、例如，上述说明书可以写在瓶子、试管和类似物、板子上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频app下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如cd、u盘、网盘等。

41、本发明首次发现了基因aldh3的负响应热胁迫农艺性状调控性。实验证明，玉米中基因aldh3失活能够提高玉米花粉耐热性。在普通玉米自交系中敲除或降低基因aldh3的表达可产生花药耐热性较好的转基因玉米；或者将基因aldh3敲除的转基因玉米导入普通玉米自交系，无论正反交，后代植株只要携带aldh3的纯合突变或降低表达，均可提高玉米花药的耐热性。因此基因aldh3的这一性质能够为改良玉米耐热性、培育耐高温玉米新品种的提供了一种遗传策略。