用于低覆盖度全基因组测序中污染检测的线粒体单倍型的制作方法

本公开属于低深度全基因组测序和遗传筛查领域。本文描述了基于线粒体dna的单倍型检测来识别测序污染的方法。

背景技术：

1、以下讨论仅为帮助读者理解本公开而提供，并不承认其描述或构成本公开的现有技术。

2、dna测序测定、样品和测序设备的污染可能影响输出的序列读段和数据，从而可能导致对下游分析和结果的错误解读。一个特定后果可能是遗传筛查的结论和结果不正确，进而可能导致疾病诊断不正确。因此，有效检测污染是利用dna测序的测定的一个重要方面。

3、目前检测dna测序测定中污染的方法依赖于对dna样品进行深度测序和高测序覆盖度，例如，查找特定基因组坐标处的等位基因失衡，其中偏离预期等位基因频率的情况代表外源dna的贡献。然而，当测序深度变得非常低（<4倍）时，该方法不可行，因为通常所有位点的测序读段都太少，无法检测到污染信号。

4、因此，非常需要用于检测测序测定和样品中的污染的方法，特别是用于低测序深度测定的方法。在低测序深度的输出中，dna提取物中的线粒体基因组通常比核基因组具有高得多的基因组覆盖度。利用低覆盖度全基因组数据中线粒体单倍型的系统发育不相容性的方法将有助于为dna测序测定提供有用的质量控制检查。

技术实现思路

1、本公开提供了通过检测线粒体dna（mtdna）中的一种或多种单倍型并将所述单倍型归入一个或多个单倍群来检测低深度dna测序中的污染的方法。另外，所公开的方法能够检测连续测序运行中一个或多个测序样品之间是否存在污染。

2、在一个方面，本公开提供了一种检测dna测序中的污染的方法，包括：(a)由从获自受试者的生物样品中提取的dna制备测序文库；(b)对所述测序文库进行低深度测序（例如，全基因组测序、全外显子组测序等），从而获得多个测序读段；(c)在所述多个测序读段中检测一种或多种线粒体dna（mtdna）单倍型，并将所述一种或多种mtdna单倍型归入一个或多个单倍群，其中，当检测到两种或更多种单倍型并将其归入两个或更多个单倍群时，测序期间存在污染，而当检测到一种单倍型并将其归入一个单倍群时，测序期间不存在污染。

3、在另一个方面，本公开提供了一种检测线粒体dna（mtdna）中的一种或多种单倍型的方法，包括：(a)获得从获自受试者的样品中提取的基因组dna；(b)对所述基因组dna进行低覆盖度下一代测序，从而获得mtdna序列读段；(c)在所述mtdna序列读段中检测一种或多种单倍型。

4、在一些实施方案中，所述dna为总基因组dna或包括经扩增的感兴趣区域。

5、在一些实施方案中，所述生物样品选自组织样品或液体样品。在一些进一步的实施方案中，所述液体样品选自血浆、血清或全血。

6、在一些实施方案中，所述低深度全基因组测序或所述低覆盖度下一代测序产生约100x至约1000x的线粒体基因组覆盖度。在一些实施方案中，所述低深度全基因组测序或所述低覆盖度下一代测序产生约0.2x至约5x的核基因组覆盖度（例如，约0.75x至约4x的核基因组覆盖度）。

7、在一些实施方案中，所述两个或更多个单倍群包括一个主要单倍群和一个或多个次要单倍群。在一些实施方案中，所述一个或多个次要单倍群包括2、3、4、5或6个次要单倍群。

8、在一些实施方案中，每个单独的次要单倍群代表一个污染来源。

9、在一些实施方案中，所述一个单倍群为主要单倍群。在一些实施方案中，检测所述一种或多种单倍型还包括将所述一种或多种单倍型归入(i)一个主要单倍群，或(ii)一个主要单倍群和一个或多个次要单倍群。

10、在一些实施方案中，其中所述污染为样品间交叉污染。

11、在一些实施方案中，其中所述多个序列读段同时用于遗传筛查。

12、在一些实施方案中，所述低覆盖度下一代测序为全基因组测序或全外显子组测序。

13、在一些实施方案中，同时对获自所述受试者的所述样品进行测序以用于遗传筛查。

14、在进一步的方面，本公开提供了一种检测一个或多个测序样品之间是否存在污染的方法，包括：(a)由从第一受试者提取的dna制备第一测序文库；(b)对所述第一测序文库进行低覆盖度全基因组测序，从而获得来自所述第一测序文库的多个测序读段；(c)由从第二受试者提取的dna制备第二测序文库；(d)使用用于对所述第一测序文库进行低覆盖度全基因组测序的同一测序仪，对所述第二测序文库进行低覆盖度全基因组测序，从而获得来自所述第二测序文库的多个测序读段；(e)在来自所述第二测序文库的所述多个测序读段中检测一种或多种线粒体dna（mtdna）单倍型，并将所述一种或多种mtdna单倍型归入一个或多个单倍群，其中，当检测到两种或更多种单倍型并将其归入两个或更多个单倍群时，测序期间存在污染，而当检测到一种单倍型并将其归入一个单倍群时，测序期间不存在污染。

15、在一些实施方案中，还包括在来自所述第一测序文库的所述多个测序读段中检测一种或多种mtdna单倍型。

16、在一些实施方案中，从所述第一受试者提取的dna、从所述第二受试者提取的dna或从所述第一受试者和所述第二受试者两者提取的dna获自独立地选自组织样品或液体样品的生物样品。

17、在一些实施方案中，所述液体样品选自血浆、血清或全血。

18、在一些实施方案中，所述低深度全基因组测序产生约100x至约1000x的线粒体基因组覆盖度。在一些实施方案中，所述低深度全基因组测序产生约0.2x至约5x的核基因组覆盖度（例如，约0.75x至约4x的核基因组覆盖度）。

19、在一些实施方案中，还包括使用从多个另外的受试者中提取的dna重复步骤(c)至(e)。在一些实施方案中，多个另外的受试者包括至少第三受试者、至少第四受试者或至少第五受试者。

20、在一些实施方案中，所述污染发生在测序样品制备期间。

21、在一些实施方案中，所述污染发生在低覆盖度全基因组测序期间。

22、在一些实施方案中，所述两个或更多个单倍群包括一个主要单倍群和一个或多个次要单倍群。在一些实施方案中，所述一个单倍群为主要单倍群。

23、在一些实施方案中，所述污染为约0.5%至约5%。在一些实施方案中，所述污染为约1%至约2.5%。污染百分比可定义为来自外源的读段所占的比例。

24、前述 技术实现要素： 和以下附图说明及具体实施方式均为示例性和解释性的。其旨在提供本公开的进一步细节，但不应解释为限制性的。根据以下本公开的具体实施方式，本领域技术人员将容易明了其他目的、优点和新颖特征。

25、应当理解，前述概念和下文更详细讨论的其他概念的所有组合均作为本文所公开的发明主题的一部分而提供，并且可以以任何组合使用，以实现本文所述的益处。

1.一种检测dna测序中的污染的方法，包括：(a)由从获自受试者的生物样品中提取的dna制备测序文库；(b)对所述测序文库进行低深度全基因组测序，从而获得多个测序读段；(c)在所述多个测序读段中检测一种或多种线粒体dna（mtdna）单倍型，并将所述一种或多种mtdna单倍型归入一个或多个单倍群，其中，当检测到两种或更多种单倍型并将其归入两个或更多个单倍群时，测序期间存在污染，而当检测到一种单倍型并将其归入一个单倍群时，测序期间不存在污染。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述dna为总基因组dna或包括经扩增的感兴趣区域。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品选自组织样品或液体样品。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述液体样品选自血浆、血清或全血。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述低深度全基因组测序产生约100x至约1000x的线粒体基因组覆盖度。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述低深度全基因组测序产生约0.2x至约5x的核基因组覆盖度。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个单倍群包括一个主要单倍群和一个或多个次要单倍群。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一个或多个次要单倍群包括2、3、4、5或6个次要单倍群。

9.根据权利要求8所述的方法，其中每个单独的次要单倍群代表一个污染来源。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述一个单倍群为主要单倍群。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述污染为样品间交叉污染。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述多个序列读段同时用于遗传筛查。

13.一种检测线粒体dna（mtdna）中的一种或多种单倍型的方法，包括：(a)获得从获自受试者的样品中提取的基因组dna；(b)对所述基因组dna进行低覆盖度下一代测序，从而获得mtdna序列读段；(c)在所述mtdna序列读段中检测一种或多种单倍型。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述低覆盖度下一代测序为全基因组测序或全外显子组测序。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述低覆盖度下一代测序产生约100x至约1000x的线粒体基因组覆盖度。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述低覆盖度下一代测序产生约0.2x至约5x的核基因组覆盖度。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中检测所述一种或多种单倍型还包括将所述一种或多种单倍型归入(i)一个主要单倍群，或(ii)一个主要单倍群和一个或多个次要单倍群。

18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中同时对获自所述受试者的所述样品进行测序以用于遗传筛查。

19.一种检测一个或多个测序样品之间是否存在污染的方法，包括：(a)由从第一受试者提取的dna制备第一测序文库；(b)对所述第一测序文库进行低覆盖度全基因组测序，从而获得来自所述第一测序文库的多个测序读段；(c)由从第二受试者提取的dna制备第二测序文库；(d)使用用于对所述第一测序文库进行低覆盖度全基因组测序的同一测序仪，对所述第二测序文库进行低覆盖度全基因组测序，从而获得来自所述第二测序文库的多个测序读段；(e)在来自所述第二测序文库的所述多个测序读段中检测一种或多种线粒体dna（mtdna）单倍型，并将所述一种或多种mtdna单倍型归入一个或多个单倍群，其中，当检测到两种或更多种单倍型并将其归入两个或更多个单倍群时，测序期间存在污染，而当检测到一种单倍型并将其归入一个单倍群时，测序期间不存在污染。

20.根据权利要求19所述的方法，还包括在来自所述第一测序文库的所述多个测序读段中检测一种或多种线粒体dna单倍型。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中从所述第一受试者提取的dna、从所述第二受试者提取的dna或从所述第一受试者和所述第二受试者两者提取的dna获自独立地选自组织样品或液体样品的生物样品。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述液体样品选自血浆、血清或全血。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述低深度全基因组测序产生约100x至约1000x的线粒体基因组覆盖度。

24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述低深度全基因组测序产生约0.2x至约5x的核基因组覆盖度。

25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，还包括使用从多个另外的受试者中提取的dna重复步骤(c)至(e)。

26.根据权利要求25所述的方法，其中多个另外的受试者包括至少第三受试者、至少第四受试者或至少第五受试者。

27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中所述污染为样品间污染。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述污染发生在测序样品制备期间。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述污染发生在低覆盖度全基因组测序期间。

30.根据权利要求19至29中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个单倍群包括一个主要单倍群和一个或多个次要单倍群。

31.根据权利要求19至29中任一项所述的方法，其中所述一个单倍群为主要单倍群。

32.根据权利要求1至13和19至31中任一项所述的方法，其中所述污染为约0.5%至约5%。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述污染为约1%至约2.5%。