一种耐热海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体及其应用的制作方法

本技术涉及一种耐热海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程。

背景技术：

1、海藻糖-6-磷酸（t6p）是植物体内重要的信号分子。在植物生长发育过程中，t6p主要通过抑制蔗糖非发酵1相关蛋白激酶（snrk1），参与淀粉积累、生长发育、分枝和成花过程，同时介导干旱、低温等非生物胁迫应答，具有作为糖信号类生物刺激素实现作物增产提质的能力，开发高效t6p合成技术是推动农业生产提质增效的重要需求。

2、酶催化合成t6p具有反应条件温和、产物产量高等优点。海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，tps）能够催化葡萄糖-6-磷酸（g6p）和udp-葡萄糖（udpg）合成t6p，但是存在底物udpg成本高，难以产业化等瓶颈。海藻糖-6-磷酸磷酸化酶（trehalose 6-phosphate phosphorylase，tpp，ec 2.4.1.216）以g6p和β-葡萄糖-1-磷酸（βg1p）为底物合成t6p，较tps催化的t6p合成反应具有底物成本优势。早在2001年，ulrikaandersson等人报道了乳酸乳球菌（

lactococcus lactis）来源的tpp具有倾向于催化底物生成t6p的能力。基于此，2026年，liu等人将镍柱纯化的麦芽糖磷酸化酶mp，聚磷酸依赖的葡萄糖激酶ppgk和tpp构建三酶催化体系，以麦芽糖和六偏磷酸钠为底物成功合成t6p。

3、微生物体内存在大量脱磷酶，会导致产物t6p脱磷生成海藻糖，降低转化率。常温菌来源的mp、ppgk和tpp等酶元件经大肠杆菌异源表达后，为了去除大肠杆菌的内源脱磷酶，现有三酶催化体系需要对酶元件进行镍柱纯化，导致酶使用成本高，限制其工业化应用。

4、因此，亟需利用酶元件挖掘和酶工程改造手段创制嗜热mp、ppgk和tpp，通过一步热处理失活大肠杆菌的内源脱磷酶，从而降低酶的使用成本，进一步推动三酶体系生产t6p的工业化。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，提供了一种耐热海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体及其应用，本技术突变体具有较好的耐热性能，可与麦芽糖磷酸化酶及聚磷酸依赖的葡萄糖激酶协同催化，以麦芽糖和聚磷酸为底物，在高温条件下高效合成海藻糖-6-磷酸，提高底物转化率。

2、本技术提供了一种耐热海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体，所述突变体的氨基酸序列为在seq id no:2所示氨基酸序列的基础上进行以下任一种氨基酸替换所得的序列：

3、1）e100m；

4、2）a106r；

5、3）t235v；

6、4）e100m/t235v；

7、5）e100m/t235v/l580y；

8、6）e100m/t235v/t510m；

9、7）e100m/t235v/t510m/e595a/a702v；

10、8）e100m/t235v/t510m/e595a/n602p；

11、9）e100m/t235v/t510m/g430s/a702v；

12、10）e100m/t235v/t510m/e595p/s607a；

13、11）e100m/t235v/t510m/g430s/a702v/e595a；

14、12）e100m/t235v/t510m/g430s/a702v/e595p/s607a；

15、其中，氨基酸残基的位置以seq id no:2所示氨基酸序列为基准编号，斜线表示所列氨基酸替换同时存在。

16、可选的，所述突变体的氨基酸序列如seq id no:4、seq id no:6或seq id no:8所示。

17、本技术提供了一种上述海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体的制备方法，将含有所述海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体编码基因的载体导入大肠杆菌，获得重组菌；培养所述重组菌，使其表达所述海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体。

18、可选的，培养重组菌后对收集的重组菌进行以下任一种处理，以获得含有所述海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体的制剂：

19、1）将所述重组菌进行热处理后获得全细胞催化剂；

20、2）破碎所述重组菌后获得粗酶液，对所述粗酶液进行镍柱纯化后获得所述海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体。

21、本技术提供了一种生物材料，所述生物材料为以下任一种：

22、1）核酸分子，所述核酸分子编码上述的海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体；

23、2）表达盒，所述表达盒包含第1）项所述的核酸分子以及与所述核酸分子可操作地连接的启动子；

24、3）重组载体，所述重组载体包含第1）项所述的核酸分子或第2）项所述的表达盒；

25、4）重组细胞，所述重组细胞包含第1）项所述的核酸分子、第2）项所述的表达盒或第3）项所述的重组载体；

26、5）全细胞催化剂，所述全细胞催化剂由第4）项所述的重组细胞表达所述海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体后，经收集和热处理制得。

27、本技术提供了一种海藻糖-6-磷酸的制备方法，以麦芽糖和聚磷酸为底物，利用麦芽糖磷酸化酶、聚磷酸依赖的葡萄糖激酶以及上述的海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体进行催化反应，生成海藻糖-6-磷酸；

28、其中，所述麦芽糖磷酸化酶催化麦芽糖与无机磷酸盐生成葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸，所述聚磷酸依赖的葡萄糖激酶利用聚磷酸作为磷酸供体催化葡萄糖生成葡萄糖-6-磷酸，所述海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体催化β-葡萄糖-1-磷酸与葡萄糖-6-磷酸生成海藻糖-6-磷酸。

29、可选的，所述麦芽糖磷酸化酶为厦门嗜热杆菌（

thermophagus xiamenensis）来源的；和/或，

30、所述聚磷酸依赖的葡萄糖激酶为嗜热假诺卡氏菌（

pseudonocardia

thermophila）来源的。

31、可选的，所述催化反应采用全细胞催化剂，所述全细胞催化剂以大肠杆菌为宿主，通过以下任一种方式制备：

32、1）分别构建表达所述三种酶中各一种酶的三种重组细胞，培养并收集各重组细胞，分别进行热处理后组合，获得所述全细胞催化剂；

33、2）构建在同一细胞中共表达所述三种酶的重组细胞，培养并收集所述重组细胞，经热处理获得所述全细胞催化剂；

34、3）构建在同一细胞中共表达所述三种酶中任意两种酶的第一重组细胞，以及表达剩余一种酶的第二重组细胞，分别培养并收集所述第一重组细胞和第二重组细胞，分别进行热处理后组合，获得所述全细胞催化剂；

35、其中，所述三种酶为所述麦芽糖磷酸化酶、所述聚磷酸依赖的葡萄糖激酶和所述海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体。

36、可选的，于50~60℃进行催化反应，生成海藻糖-6-磷酸。

37、可选的，制备海藻糖-6-磷酸的催化体系中还包括氯化镁和/或硫酸镁。

38、本技术的有益效果包括但不限于：

39、与现有技术相比，本技术提供的海藻糖-6-磷酸磷酸化酶突变体具有提高的热稳定性，其中，e100m/t235v/t510m/g430s/a702v/e595p/s607a组合突变体在60℃下的半衰期达到17.3 h，比酶活为野生型的1.7倍。将突变体与耐热麦芽糖磷酸化酶及聚磷酸依赖的葡萄糖激酶联合使用，可在55℃下以麦芽糖和聚磷酸为底物高效合成海藻糖-6-磷酸，麦芽糖的摩尔转化率达到94.3%。

40、此外，通过热处理表达相应酶的重组细胞，可制备全细胞催化剂，减少宿主内源脱磷酶引起的产物损失，并提高细胞通透性，无需进行酶的分离纯化，有利于降低催化剂制备成本，实现海藻糖-6-磷酸的规模化生产。