一种慢病毒质粒、高脑转移特性乳腺癌细胞系及其筛选方法、乳腺癌脑转移小鼠模型的构建方法与应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种慢病毒质粒、高脑转移特性乳腺癌细胞系及其筛选方法、乳腺癌脑转移小鼠模型的构建方法与应用。

背景技术：

1、乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤‌，主要由乳腺上皮细胞增殖失控引起。绝大多数乳腺癌相关死亡由肿瘤转移所致，而非原发灶本身。在众多转移靶器官中，大脑是乳腺癌主要的转移部位。乳腺癌脑转移不仅会引发头痛、恶心、视力障碍及肢体麻木无力等严重神经系统症状，极大缩短患者生存期，更因药物难以透过血脑屏障而陷入临床治疗困境。因此，深入探索乳腺癌脑转移的分子机制，阐明肿瘤细胞侵入大脑的方式与途径，是突破当前临床治疗瓶颈的关键。而为了开展相关研究，构建高保真、高灵敏度的乳腺癌脑转移动物模型显得尤为重要。

2、尽管目前已有多种肿瘤转移模型被应用于研究，但在乳腺癌脑转移领域，现有技术仍存在显著的局限性，难以满足深入机制研究和药物筛选的需求。例如，cn1264429a专利公开了一种以绿色荧光蛋白（gfp）为标记的肿瘤转移模型，其使用慢病毒载体构建gfp-甲硫氨酸酶表达质粒和gfp-sv40t抗原表达质粒，包装病毒后感染细胞构制作出gfp标记的肿瘤细胞；再将gfp标记的肿瘤细胞移植到小鼠体内生长成瘤，从而实现对肿瘤细胞的标记。然而使用gfp荧光蛋白标记的肿瘤细胞需要解剖小鼠后制作成切片，才能在显微镜下观察转移灶的位置，无法实现活体动态追踪，难以实时反映肿瘤细胞在体内的迁移路径和定植过程。又如，cn114258897a专利公开了一种诱导结肠癌高频转移的黑腹果蝇模型的建立方法，其通过遗传操纵ras、lgl和sna等肿瘤相关因子的表达从而建立高效结肠癌转移果蝇模型，包括使用多个基因突变的亲本转基因果蝇杂交的方式产生目的基因子代果蝇，继而进行37℃热激诱导基因表达驱动结肠癌的发生以及后续的转移发生。然而，肿瘤的转移是个多因素促发的事件，果蝇与人在基因表达上的差异一定程度上阻碍了研究的深入开展。相比之下，小鼠与人类基因组相似度高达90%，是研究癌症转移机制更为理想的选择。再如，cn117898256a专利公开了一种乳腺癌骨转移小鼠模型的构建方法。该专利使用髂内动脉注射的方式构建乳腺癌骨转移模型小鼠。首先诱导乳腺癌进入耐药模式，然后为受体小鼠注射耐药细胞培养上清营造骨转移前微环境，最后通过髂内动脉注射的方式构建乳腺癌骨转移模型小鼠。但这种方法主要针对骨组织，无法模拟乳腺癌脑转移的全过程。此外，现有其他的小鼠脑转移模型的构建方法还存在脑转移发生率低下、示踪信号微弱等问题。更重要的是，现有转移模型普遍缺乏对肿瘤细胞经血液循环最终定植于大脑的自然转移路径的关注，使得研究人员难以全面评估血脑屏障对药物递送的阻碍作用，也无法有效筛选能够穿透血脑屏障的高效靶向药物。

3、因此，临床研究迫切需要一种能够模拟乳腺癌脑转移真实生物学过程、具备高脑转移效率、且支持活体无创高灵敏示踪的小鼠模型构建方法，以期为乳腺癌脑转移的机制解析及新药研发提供更有力的工具。

技术实现思路

1、有鉴于此，为克服现有技术在乳腺癌脑转移研究中示踪手段滞后、模型构建效率低等缺陷，本发明通过构建一种特异性携带新型近红外萤光素酶基因akaluc与绿色荧光蛋白基因egfp的慢病毒质粒，并创新性地结合左心室注射-脑转移灶分离-流式分选-再注射的多轮体内循环筛选策略，成功筛选并获得了具有极高脑转移倾向且支持无创实时活体监测的高保真乳腺癌细胞系及其构建的小鼠模型。本发明为深入解析乳腺癌脑转移的分子机制及开发穿透血脑屏障的靶向药物提供了强有力的工具。

2、本发明的目的之一在于提供一种慢病毒质粒。

3、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、一种慢病毒质粒，所述慢病毒质粒携带akaluc萤光素酶基因和egfp绿色荧光蛋白基因，其核苷酸序列如seq id no：11所示。

5、本发明的目的之二在于提供一种高脑转移特性乳腺癌细胞系。

6、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

7、一种高脑转移特性乳腺癌细胞系，所述细胞系含有前述慢病毒质粒，所述细胞系的脑转移率≥90%。

8、优选地，所述细胞系命名为高脑转移小鼠乳腺癌细胞brm5-4t1 mus musculus，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2026178。

9、本发明的目的之三在于提供一种筛选高脑转移特性乳腺癌细胞系的方法。

10、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

11、一种筛选高脑转移特性乳腺癌细胞系的方法，包括如下步骤：

12、s1：将包装质粒vsvg、rre和前述慢病毒质粒共转染至293t细胞，包装慢病毒，获得含有慢病毒的细胞培养上清液；使用所述含有慢病毒的上清液感染乳腺癌细胞，筛选得到稳定表达akaluc和egfp标记的乳腺癌细胞；

13、s2：将s1所得乳腺癌细胞注射到小鼠体内，通过活体成像观察肿瘤细胞在体内的分布及转移定植状态；

14、s3：从发生脑转移的小鼠脑部组织中分离肿瘤细胞，通过流式细胞术分选egfp荧光标记阳性细胞，获得具有高脑转移特性的子代细胞；

15、s4：以s3所得子代细胞作为下一轮筛选的接种细胞，重复步骤s2~s3，经过5轮循环筛选，获得具有高脑转移特性的乳腺癌细胞系。

16、优选地，s1中，所述包装质粒vsvg、所述rre和所述慢病毒质粒的质量比为1：3：4。

17、作为优选的方案，s1具体包括：将包装质粒vsvg、rre、慢病毒质粒和opti-mem混合，加入聚乙烯亚胺溶液，室温静置15~30分钟后添加到提前铺种好的293t细胞中，转染细胞4~6小时；更换培养基，进行包装慢病毒；转染293t细胞40~60小时进行回收、过滤，得到病毒液；将所得病毒液与聚凝胺混合后，加入到乳腺癌细胞中，感染过夜；使用嘌呤霉素筛选细胞，获得akaluc-egfp标记的乳腺癌细胞系。

18、更优选地，将包装质粒vsvg、rre、慢病毒质粒和opti-mem混合，加入聚乙烯亚胺溶液，室温静置20分钟后添加到提前铺种好的293t细胞中，转染细胞4小时；更换培养基，进行包装慢病毒；转染293t细胞48小时进行回收、过滤，得到病毒液。

19、更优选地，所有质粒（包装质粒vsvg、rre和慢病毒质粒）和opti-mem、聚乙烯亚胺溶液的质量体积比为1(μg)：20~30(μl)：3~5(μl)，更优选为1：25：3。

20、更优选地，聚乙烯亚胺溶液的浓度为0.5~5 mg/ml，更优选为1mg/ml。

21、更优选地，病毒液和聚凝胺溶液的体积比为500：0.5~2，更优选为500：1。

22、更优选地，所述聚凝胺溶液的浓度为5~15 mg/ml，更优选为10mg/ml。

23、更优选地，待细胞长至70%满度时，使用嘌呤霉素筛选细胞。

24、更优选地，筛选好的细胞在荧光显微镜下可见明显的egfp绿色荧光。

25、优选地，s1中，所述乳腺癌细胞为4t1小鼠乳腺癌细胞。

26、优选地，s2中，注射方式为左心室注射。

27、优选地，s2中，当小鼠脑部检测到明显的akaluc萤光信号，且小鼠出现肢体瘫痪、活动机能失调、进食困难等状况，表示乳腺癌细胞发生脑转移。

28、优选地，s3中，将分离出的脑组织肿瘤细胞进行体外培养，形成细胞克隆集团；使用流式细胞仪对培养后的细胞进行分选，收集egfp强阳性细胞群，扩增培养后获得第一代脑转移乳腺癌细胞；所述egfp强阳性细胞群是相较于4t1亲本细胞，荧光强度在102以上的egfp阳性细胞群。

29、更优选地，所述体外培养包括：将脑组织消化后，使用含10%胎牛血清的高糖dmem培养基培养3天至细胞贴壁，随后更换培养基，继续培养至形成细胞克隆集团。

30、优选地，s4中，随着筛选轮次的增加，每次注射的肿瘤细胞数量逐步递减。

31、更优选地，s4中，第一次注射细胞数量为3×105个细胞/100μl；第二次注射细胞数量为1×105个细胞/100μl；第三次注射细胞数量为0.5×105个细胞/100μl；第四次注射细胞数量为0.2×105个细胞/100μl；第五次注射细胞数量为0.08×105个细胞/100μl。

32、更优选地，5轮筛选均采用左心室注射。

33、更优选地，s2~s4中，实验小鼠为balb/c小鼠。

34、更优选地，s2~s4中，实验小鼠为6周龄balb/c雌性小鼠。

35、本发明的目的之四在于提供一种乳腺癌脑转移小鼠模型的构建方法。

36、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

37、乳腺癌脑转移小鼠模型的构建方法，将前述高脑转移特性乳腺癌细胞系注射到小鼠体内，得到乳腺癌脑转移小鼠模型。

38、优选地，细胞注射数量为1×104个细胞/100μl~5×104个细胞/100μl。

39、优选地，细胞注射数量为1×104个细胞/100μl。

40、优选地，小鼠为balb/c小鼠。

41、优选地，小鼠为6周龄balb/c雌性小鼠。

42、优选地，注射方式为左心室注射。

43、本发明的目的之五在于提供一种前述慢病毒质粒和/或前述高脑转移特性乳腺癌细胞系在构建乳腺癌脑转移小鼠模型中的应用。

44、本发明的目的之六在于提供一种前述高脑转移特性乳腺癌细胞系和/或前述方法构建所得乳腺癌脑转移小鼠模型在筛选或评价抗乳腺癌脑转移药物中的应用。

45、本发明的有益效果在于：

46、1、本发明提供的乳腺癌脑转移小鼠模型，能够有效模拟乳腺癌发生转移的路径和方式，还原乳腺癌发生脑转移的基因表达和代谢重编程等机制，更有助于科研人员对乳腺癌脑转移的发生机制和转移途径进行深入研究，促进乳腺癌脑转移靶向药物的开发。

47、2、本发明使用新型萤光素酶akaluc基因与egfp共表达体系，既保证了制作的高脑转移细胞可以通过流式细胞仪分选egfp阳性细胞，又可以保证egfp阳性细胞中akaluc萤光素酶的稳定表达，新型萤光素酶akaluc组织透过性好，示踪灵敏度高，使用活体成像可以更方便地追踪肿瘤细胞转移的路径。

48、3、本发明提供的用于筛选高脑转移特性乳腺癌细胞系的方法，细胞可在体外培养后使用流式分选肿瘤细胞，方便筛选出发生转移的肿瘤细胞。

49、4、本发明提供的小鼠乳腺癌细胞brm5-4t1转移能力强，少量细胞即可发生脑转移。