一种用于培养类器官与3D肿瘤球的基质胶材料及其制备方法

本发明涉及生物医学材料，尤其涉及一种用于培养类器官与3d肿瘤球的基质胶材料及其制备方法。

背景技术：

1、恶性肿瘤具备侵袭、转移与复发的特征，是造成肿瘤患者死亡的核心诱因。肿瘤转移过程中，肿瘤细胞脱离原发灶、穿透胞外基质并进入循环系统，逃逸机体免疫清除后形成循环肿瘤细胞；依托体外类器官培养模型，能够直观重现细胞增殖、侵袭特性，是抗肿瘤药物筛选、病理机制研究的重要工具。传统二维平面细胞培养体系缺少立体支撑结构与体内原生力学微环境，细胞增殖、药物响应行为与体内真实状态差距明显，难以精准评估药物杀伤效果。

2、近年来体外类器官培养技术快速发展，现有的三维支撑材料主要包含人工合成水凝胶、商用天然基质胶两类，虽均可实现细胞三维组装形成类器官，但仍存在各类缺陷：人工合成水凝胶缺少天然胶原、黏附活性蛋白，微环境仿生程度低；商用基质胶成分不明确、批次稳定性差、制备与保存条件严苛、使用成本高，且易产生大量杂细胞非特异性黏附，干扰后续药效检测。

3、脱细胞胞外基质是一类生物相容性优良的天然三维支架材料，富含内源活性生长因子与细胞结合位点。现有脱细胞基质制备工艺纯化流程存在明显不足；同时缺乏标准化的基质稀释、中和配比方案，凝胶硬度、成型效果难以稳定控制。

技术实现思路

1、为了克服以上不足，本发明的目的在于提供一种用于培养类器官与3d肿瘤球的基质胶材料及其制备方法，以解决现有商用三维培养基质仿生差、成本高、杂细胞吸附干扰检测，传统脱细胞基质纯化不足、力学性能不可控，二维细胞模型无法还原体内肿瘤真实微环境。

2、为实现上述目的，本发明一方面提供了一种用于培养类器官与3d肿瘤球的基质胶材料的制备方法，包括以下步骤：

3、步骤 1，取猪小肠，去除淋巴结与黏液后4℃纯水预处理；

4、步骤2，采用 1% 硫酸庆大霉素溶液作为抑菌剂，4℃持续搅拌处理小肠碎片 4h除菌；

5、步骤 3，采用预冷 pbs 缓冲液作为缓冲液，4℃搅拌漂洗小肠碎片 4h，去除残留抑菌剂；

6、步骤 4，采用 80mmol/l 脱氧胆酸钠溶液 4℃持续搅拌 4h 处理小肠碎片，裂解小肠组织 dna；

7、步骤 5，采用预冷 pbs 缓冲液分 2 轮缓冲液 4℃漂洗，每轮搅拌漂洗 4h，去除脱氧胆酸钠与核酸裂解产物；

8、步骤 6，测定小肠组织干湿质量比；

9、步骤 7，依据干湿比换算湿小肠组织，液氮冷冻研磨得到小肠粉末；

10、步骤 8，向小肠粉末添加占粉末质量 1/10 的胃蛋白酶，调节体系 ph 至 2 后 4℃消化，消化时长控制为 24h～48h；

11、步骤 9，冰浴条件下滴加碱液调节 ph 终止酶解；

12、步骤 10，将匀浆置于由1.8l 0.01mol/l 稀盐酸与 200ml 0.5% 过氧乙酸混合配制的酸性氧化剂复配体系中 4℃透析 1h 除杂；

13、步骤 11，以定量透析后基质原液为基准梯度添加纯水稀释，透析后基质流体通过添加纯水梯度稀释，得到干物质浓度为 8mg/ml～20mg/ml 的基质原液；向该基质原液加入碱液中和后于4℃交联成型，得到固态猪小肠脱细胞 ecm 基质胶。

14、本发明另一方面还提供了一种用于培养类器官与3d肿瘤球的基质胶材料，所述基质胶以猪小肠为原料，经脱氧胆酸钠脱核酸、胃蛋白酶低温复合脱细胞处理得到脱细胞胞外基质，基质由胶原蛋白、透明质酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白与多肽交联形成三维蛋白网络，保留猪小肠内源活性生长因子；基质原液干物质浓度为 8mg/ml～20mg/ml；改变预凝胶原液的纯水添加量可调控凝胶交联密度，改变凝胶硬度与粘弹性；所述三维蛋白网络与脑胶质瘤细胞表面整合素特异性结合，诱导形成3d肿瘤球、类器官；经脱细胞脱核酸后免疫原性弱，降低星形胶质细胞、外周血细胞附着；适配u87mg 细胞，3d肿瘤球成型成功率不低于90%。

15、借由以上的技术方案，本申请的有益效果在于：

16、第一，本发明分步纯化工艺可逐层去除各类有害杂质：经步骤2、3处理后，小肠碎片中的微生物、抗生素残留得以有效去除；经步骤4、5处理后，组织内完整dna充分裂解，核酸杂质被大幅清除；步骤10透析可去除匀浆中小分子免疫杂质，降低所得基质胶的免疫原性。

17、第二，基于猪小肠组织制备的脱细胞 ecm 基质胶，原料易得、整套制备流程简便可控，通过标准化脱细胞、脱 dna 工艺搭配固定配比的稀释体系与氢氧化钠中和方案，可稳定复刻体内细胞生长的硬度、粘弹性微环境，高效支撑细胞构建三维肿瘤球与类器官，适用于大批量抗肿瘤药物体外筛选，成本低廉，推广应用价值高。

1.一种用于培养类器官与3d肿瘤球的基质胶材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤 1 中，猪小肠长度为30cm，去除黏液后置于冷藏纯净水中浸泡 3h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，经步骤 5处理后组织内完整dna充分裂解。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤 6 中，挤干小肠碎片表面缓冲液称量湿重，另取等量组织冷冻干燥后称量干重，计算干湿质量比；步骤 7 中，依据干湿比换算称取对应干重1g的小肠湿组织进行液氮冷冻研磨。

5.根据权利要求 1 所述的制备方法，其特征在于，步骤 11 中，以 300μl 透析后基质原液为基准，添加 0μl、50μl、100μl、200μl 或 450μl 纯水梯度稀释，对应制得干物质浓度20mg/ml、17mg/ml、15mg/ml、12mg/ml、8mg/ml 的基质原液。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，成型配比为：取 300μl 透析后基质原液，添加 100μl 纯水稀释，再加入 3.6μl 1mol/l naoh 溶液中和，4℃交联，制得干物质浓度 15mg/ml 的基质原液，交联后得到适配脑胶质瘤细胞培养的固态基质胶。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤 2 至步骤 5 的除菌、漂洗、脱核酸处理，以及步骤 8 的酶解消化、步骤 10 的透析纯化、步骤 11 的中和交联，均在 4℃低温条件下进行；其中步骤 11 中，向梯度稀释后的基质原液加入碱液中和后，静置交联5min 完成固态基质胶成型。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，当基质原液干物质浓度为15mg/ml时，所得基质胶储能模量 g'为1200~2000pa，损耗模量g''为100~400pa。

9.一种用于培养类器官与3d肿瘤球的基质胶材料，其特征在于，所述基质胶以猪小肠为原料，经脱氧胆酸钠脱核酸、胃蛋白酶低温复合脱细胞处理得到脱细胞胞外基质，基质由胶原蛋白、透明质酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白与多肽交联形成三维蛋白网络，保留猪小肠内源活性生长因子；基质原液干物质浓度为 8mg/ml～20mg/ml；改变预凝胶原液的纯水添加量可调控凝胶交联密度，改变凝胶硬度与粘弹性；所述三维蛋白网络与脑胶质瘤细胞表面整合素特异性结合，诱导形成3d肿瘤球、类器官；经脱细胞脱核酸后免疫原性弱，降低星形胶质细胞、外周血细胞附着；适配u87mg 细胞，3d肿瘤球成型成功率不低于90%。

10.权利要求9所述基质胶材料在培养脑胶质瘤类器官、构建体外脑胶质瘤 3d 肿瘤球模型中的用途。