一种用于人外周血来源的脑胶质瘤循环肿瘤细胞体外培养的选择性培养基、染色鉴定方法及应用与流程

本发明属于生物医学工程、临床检验诊断，具体涉及适配人外周血来源脑胶质瘤循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, ctcs）的无血清选择性体外扩增培养基、配套多重免疫荧光特异性染色鉴定方法，以及包含该体系的 ctc 检测试剂盒；可用于脑胶质瘤无创早期筛查、术后微小残留病灶监测、肿瘤复发预警、患者原代细胞体外药敏筛选与胶质瘤耐药机制研究。

背景技术：

1、脑胶质瘤（glioma）是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，具有高度的侵袭性和异质性。脑胶质瘤的发生发展伴随血脑屏障（bbb）的病理性重构。紧密连接蛋白（如claudin-1、claudin-5、occludin）的表达下调导致bbb完整性丧失、通透性升高。

2、bbb的破坏为胶质瘤细胞进入外周血创造了条件。一方面，肿瘤细胞（包括胶质瘤干细胞）通过上皮-间充质转化（emt）获得侵袭表型，分泌蛋白酶降解血管基底膜后发生内渗，直接进入血流。另一方面，胶质瘤干细胞具有多能分化特性，可分化为拟态血管内皮细胞，此类细胞可能从血管壁脱落进入循环，形成循环肿瘤细胞（ctc）。

3、综上所述，脑胶质瘤患者bbb的病理性破坏以及肿瘤细胞自身的侵袭和分化能力，共同构成了在外周血中捕获胶质瘤ctc的理论基础，为本技术的实施提供了科学依据。

4、临床价值与技术创新：恶性胶质瘤是最为常见的颅内恶性肿瘤，由脑内健康细胞及初级星型胶质瘤转化而来，多数情况下发病原因不明。此类肿瘤没有预防办法，确诊后的一般存活期为12～15个月，目前较为有效的治疗方法为与放化疗结合的手术切除治疗，然而由于此类肿瘤一般为浸润型生长，无明确边界，术后复发率极高，且胶质瘤在个体间高度异质性。

5、胶质瘤目前在临床研究上的难点在于：无法进行体内深入研究个体差异较大；胶质瘤细胞目前体外培养的难点在于：取材困难，培养成本巨大，尚无可靠的培养规范，培养时间长，难度大。 通过体外培养病人来源的胶质瘤细胞，建立体外恶性胶质瘤疾病模型，可以从细胞分子角度去深入研究疾病机理，并且可以有针对性的利用此类细胞进行临床前药物筛选及药敏评估，无论从研究还是应用都能够实现更高的靶向性，所得结果与通过动物细胞为模型得来相比更为准确。

6、传统的脑胶质瘤细胞获取方式依赖于开颅手术，存在创伤大、风险高且难以反复取样等固有局限性。相较于传统侵入性活检，外周血ctc捕获技术实现了从“开颅活检”到“液体活检”的跨越：仅需采集外周血即可检测胶质瘤来源的肿瘤细胞，具有微创、便捷、可重复等优势。临床研究数据显示，ctc检测对胶质瘤诊断的受试者工作特征曲线下面积（auc）可达0.918–0.939，不仅可辅助鉴别脑转移瘤与良性肿瘤，还可用于监测术后微小残留病灶（mrd），其复发预警时间较影像学检查提前2–3个月。此外，ctc保留了完整细胞的表型特征及基因组信息，可动态反映肿瘤异质性与治疗耐药性演变，为脑胶质瘤的无创诊断、疗效评估及治疗监测提供了重要的技术支撑与临床解决方案。

7、现有相关技术局限性分述如下：

8、①　专利 cn111979197a（2020年11月24日公开）公开一种脑胶质瘤干细胞无血清培养基，但该培养基针对手术切除肿瘤组织分离的胶质瘤干细胞设计，未考虑外周血 ctc脱离基质后的失巢凋亡损伤，无法支撑微量循环肿瘤细胞稳定扩增；

9、②　现有技术如cn121780437a（2026年4月3日公开）公开了一种肾细胞癌循环肿瘤细胞培养基及培养方法，只是特定肾细胞癌患者外周血的循环肿瘤细胞，不能用于脑胶质瘤来源的循环肿瘤细胞培养。

10、③　现有技术如cn122146586a（2026年6月5日公开）公开了一种肺类器官的培养基，其中添加了n-乙酰半胱氨酸，但是不涉及脑胶质瘤细胞培养。

11、现有技术中，针对外周上皮来源肿瘤（如肺癌、乳腺癌）的ctcs培养和鉴定技术较为成熟，通常利用特定抗体，如epcam（上皮细胞粘附分子）抗体进行正向富集，并采用含血清的高糖dmem培养基进行培养。然而，脑胶质瘤ctcs具有以下特殊性：

12、(1)上皮-间充质转化表型：胶质瘤ctcs通常不表达或低表达epcam，导致传统的免疫磁珠富集法效率极低。

13、(2)易凋亡特性：脱离基质后的胶质瘤细胞在血液中极易失巢凋亡，现有培养基难以维持其活性并实现扩增。

14、(3)鉴定困难：由于血细胞背景复杂，常规染色难以区分具有干细胞特性的胶质瘤细胞与反应性星形胶质细胞或单核细胞。

15、现有技术仅能单独解决组织胶质瘤干细胞培养、上皮癌 ctc 富集、肺类器官抗氧化培养单一问题，尚无一套同时适配外周血微量胶质瘤 ctc 抗失巢凋亡扩增 + 高特异性分型鉴定的成套技术体系。本发明核心区别于现有技术：靶标为外周血循环游离胶质瘤ctc，而非手术组织细胞；采用 y-27632+pdgf-aa+lif+n - 乙酰半胱氨酸复合配方协同抑制凋亡、维持干细胞特性，该组合在现有胶质瘤细胞培养基中未见公开报道。

16、因此，开发一种专门针对外周血脑胶质瘤ctcs的体外培养体系及高特异性的染色鉴定方法，对于胶质瘤的早期转移预警、疗效评估及个体化药物筛选具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明提供了一种用于脑胶质瘤循环肿瘤细胞体外培养的选择性培养基配方，以及配套的细胞染色鉴定方法，旨在解决现有技术中脑胶质瘤ctcs捕获难、扩增难、鉴定准确率低的技术问题。

2、培养基配方：

3、为达上述目的，本发明提供一种无血清、添加特定生长因子组合的选择性培养基，以下简称gcm-s（selective）培养基，胶质瘤条件培养基gcm-s（selective），其组分包括基础培养基及添加物。

4、具体配方（浓度均为终浓度）：

5、- 基础培养基：dmem/f12（1:1）；

6、- 添加剂：

7、- b27 添加剂：1-3%（体积比）；

8、- n2 添加剂：0.5-2%（体积比）；

9、- 表皮生长因子egf：10-30 ng/ml；

10、- 碱性成纤维细胞生长因子bfgf：10-30 ng/ml；

11、- 血小板衍生生长因子（pdgf-aa）：5-15 ng/ml；

12、- 白血病抑制因子lif：5-15 ng/ml；

13、- n-乙酰半胱氨酸：0.1-2 mm；

14、- y-27632：5-15 µm。

15、关键组分作用解析：

16、①　- y-27632：作为rho相关蛋白激酶抑制剂，能够显著抑制上皮来源肿瘤细胞和神经外胚层来源细胞的失巢凋亡，这对于在悬浮或半悬浮状态下培养血液中捕获的ctcs至关重要。

17、②　- pdgf-aa + lif：模拟胶质瘤干细胞的高级别微环境，促进具有干细胞特性的ctcs增殖，同时抑制分化。

18、③　- n-乙酰半胱氨酸：作为抗氧化剂，降低氧化应激损伤，提高ctcs在体外的存活率。

19、细胞染色鉴定方法：本发明提供一种五指标多重免疫荧光联合鉴定体系，用于精准区分脑胶质瘤 ctcs 与外周血背景白细胞、正常胶质细胞。

20、标记物组合方案：

21、①　gfap：胶质纤维酸性蛋白，alexa fluor 488（绿色）标记，用于确认为胶质细胞来源。

22、②　olig2：少突胶质细胞转录因子2，pe（红色）标记，用于支持胶质瘤诊断。

23、③　cd45：白细胞共同抗原，alexa fluor 647（远红/紫色）标记，用于背景排除。

24、④　s-100：s100钙结合蛋白，在胶质瘤中阳性率接近100%，是经典的胶质细胞标志物。pe（红色）标记，用于支持胶质瘤诊断。

25、⑤　dapi：细胞核染料，蓝色标记。

26、判定标准：

27、- 阳性判定：dapi+/gfap+/olig2+/s-100+/cd45-。

28、- 排除标准：cd45+ 或 dapi阴性均视为非目标细胞。