一种DNA甲基化测序文库构建试剂、构建方法及应用与流程

本发明属于高通量单细胞基因组测序，涉及一种dna甲基化测序文库构建试剂、构建方法及应用。

背景技术：

1、dna甲基化是最常见、研究最深入的表观遗传修饰之一，它是指在dna分子上（通常是胞嘧啶碱基的5’碳位）添加一个甲基基团的化学过程，这种修饰不改变dna序列本身，但会显著影响基因的表达，在基因表达调控、基因组印迹、胚胎发育及疾病发生（如癌症）中扮演着核心角色。在复杂的组织微环境中，细胞异质性普遍存在，因此在单细胞分辨率下解析dna甲基化图谱，对于揭示细胞命运决定、疾病异质性及精准医学研究具有不可替代的价值。

2、当前在单细胞甲基化研究中，常用的化学法亚硫酸氢盐转化或酶学转化方法均采用c→t反向转化策略，将未甲基化的胞嘧啶（c）与甲基化的胞嘧啶（5mc）区分开来。如cn111394801a公开一种基于illumina测序平台的多重单细胞简化代表性甲基化文库的构建方法，包括：(1)单细胞裂解或微量dna提取和纯化；(2)限制性内切酶msp i消化；(3)末端修复和3’端加a；(4)带标签的甲基化接头连接；(5)亚硫酸氢盐转化非甲基化胞嘧啶；(6)甲基化文库pcr富集；(7)对相似大小的甲基化文库进行混合和illumina平台测序。

3、然而，现有方法存在若干局限性：其一，无法直接兼容现有商业化的单细胞标签系统，需重新设计并合成具有抗转化修饰的专用标签，增加了制备成本与技术门槛；其二，反向转化导致测序数据中t碱基比例异常增高，严重影响后续与参考基因组的比对效率，流程复杂且耗时较长；其三，在转化效率评价方面，现有方法通常依赖引入外源性内参dna片段，并通过其整体转化率间接代表样本中所有片段的转化水平。然而，细胞内基因组经转座酶片段化后的dna片段长度分布广泛，通常在200~2500 bp之间，而内参dna长度均一，无法真实反映因片段长度差异所导致的转化效率偏差。尤其在涉及dna变性的转化过程中，片段长度直接影响变性效率，进而影响最终转化效果。

4、tet酶辅助吡啶硼烷测序（tet-assisted pyridine borane sequencing，taps）技术为一种新兴的正向转化技术，该技术联合利用工程化tet酶（如tet2）与吡啶硼烷化学试剂，可特异性地将5-甲基胞嘧啶（5mc）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmc）氧化并脱氨，转化为二氢尿嘧啶（dhu），后者在pcr扩增中被读取为胸腺嘧啶（t），而未修饰的胞嘧啶（c）则保持原样。这一特性使得最终序列中的碱基组成更接近天然dna，解决了反向转化导致的序列扭曲问题。然而，如何将taps技术的优势与高效的单细胞文库构建流程相结合，并巧妙设计以实现片段级的转化效率自校正，目前仍鲜有报道。

5、因此，如何在单细胞水平上实现对每一条测序片段真实转化效率的精准评估，成为该领域亟待解决的关键问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种dna甲基化测序文库构建试剂、构建方法及应用，以期克服现有技术在效率评估与系统兼容性方面的问题，在数据层面提供更高清晰度、更高可靠性、更全信息维度的底层测序数据，尤其适用于需要在单细胞分辨率下整合表观遗传与遗传变异信息的复杂生物学机制研究与精准医学临床应用中。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种用于dna甲基化测序文库构建的试剂，所述试剂包括转座酶复合体，所述转座酶复合体包括转座酶和转座子，所述转座子中包括接头序列和转座酶识别序列（me），所述接头序列中包括与测序引物序列不同的连接序列，所述转座子中连接序列区域或转座酶识别序列区域中至少一个已知位置的胞嘧啶碱基具有甲基化修饰。

4、本发明设计特定组成的转座酶复合体，在转座酶介导的片段化与接头引入过程中，于转座子序列中引入已知位置的胞嘧啶甲基化修饰，经转化扩增后，该修饰碱基被特异性转化为胸腺嘧啶，通过统计该位点在每一条测序读段（read）中的转化比例，即可直接、客观地反映该read所对应dna片段的实际转化效率。

5、优选地，所述甲基化修饰包括5-甲基胞嘧啶修饰（5mc）或5-羟甲基胞嘧啶（5hmc）修饰。

6、优选地，所述转座酶包括tn5转座酶。

7、第二方面，本发明提供第一方面所述的用于dna甲基化测序文库构建的试剂在构建单细胞dna甲基化测序文库中的应用。

8、第三方面，本发明提供一种用于dna甲基化测序文库构建的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于dna甲基化测序文库构建的试剂和tet酶辅助吡啶硼烷测序试剂。

9、本发明将特定组成的转座酶复合体和taps正向转化技术相结合，设计文库构建方案，在转座酶介导的片段化与接头引入过程中，于转座子序列中引入甲基化修饰胞嘧啶碱基，经taps转化并pcr扩增后，该修饰碱基被特异性转化为胸腺嘧啶。通过统计该位点在每一条测序read中的转化比例，即可直接、客观地反映该read所对应dna片段的实际转化效率。此外，taps技术具有正向转化特性，仅将5mc/5hmc转化为t，而未修饰的胞嘧啶得以保留，从而使最终序列中四种碱基组成更为均衡，显著提升了5mc→t转化事件的识别准确度。该特性还使得同一测序数据能够同步用于检测单核苷酸变异与拷贝数变异等多维度遗传信息，实现表观遗传修饰与基因序列变异的一体化分析。

10、优选地，所述tet酶辅助吡啶硼烷测序试剂包括tet酶和吡啶硼烷。

11、第四方面，本发明提供一种构建dna甲基化测序文库的方法，所述方法包括：

12、将待测dna与第一方面所述的用于dna甲基化测序文库构建的试剂混合，得到片段化dna，使用tet酶辅助吡啶硼烷测序试剂对片段化dna进行转化处理，以转化处理后产物为模版，进行第一轮pcr扩增，再对扩增产物进行第二轮pcr扩增或打断后进行第二轮pcr扩增，得到测序文库。

13、优选地，所述第一轮pcr扩增和第二轮pcr扩增中的引物包括通用测序平台引物。

14、优选地，所述待测dna包括单细胞dna。

15、第五方面，本发明提供第一方面所述用于dna甲基化测序文库构建的试剂、第三方面所述的用于dna甲基化测序文库构建的试剂盒或第四方面所述的构建dna甲基化测序文库的方法在dna甲基化测序中的应用。

16、第六方面，本发明提供一种dna甲基化测序方法，所述dna甲基化测序方法包括：

17、利用第四方面所述的构建dna甲基化测序文库的方法构建测序文库，对所述测序文库进行测序，对所述测序的结果进行数据分析。

18、优选地，所述数据分析包括：

19、数据拆分与比对：根据细胞条形码拆分测序数据，并将读段比对至参考基因组；

20、内标识别与统计：针对每一条比对上的有效读段，识别其来源的转座子序列，提取其中已知甲基化修饰位点的碱基读取信息；

21、效率计算：统计该读段已知甲基化修饰位点被读取为“t”和“c”的比例，按公式“片段转化效率=t读数比例/(t读数比例+c读数比例)”计算该读段的转化效率；

22、甲基化水平校正：利用计算得到的转化效率，对该读段上所有检测到的基因组胞嘧啶位点的表观甲基化水平进行校正，获得甲基化图谱。

23、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

24、（1）实现了转化效率评估的“从宏观到微观”、从间接到直接的范式转变：本发明通过将甲基化内标（如5mc）设计在转座子中，实现了对每一条测序读长（即每一个dna片段）转化效率的原位、直接测量，这解决了传统外源性均一内参无法反映片段长度依赖性转化效率差异的根本缺陷，为单细胞甲基化数据的绝对定量和高质量质控提供了可靠工具。

25、（2）提升系统兼容性与成本效益：本发明直接利用taps技术不攻击普通c碱基的特性，能够无缝兼容市面上主流的、未经过特殊修饰的商业化标签与接头系统，这彻底省去了定制“抗转化”接头的昂贵费用和漫长周期，大幅降低了基因甲基化研究的资金与技术门槛，有利于技术的标准化和推广。

26、（3）提升数据质量：taps正向转化产生的序列中，四种碱基比例接近天然dna，极大缓解了序列扭曲问题，这使得测序读长与参考基因组的比对效率（mapping rate）和比对精度显著提高（预计比对率可从传统方法的不足70%提升至90%以上），同时简化了后续分析流程，节省了计算资源。

27、（4）赋能多组学整合分析：由于遗传序列信息（c碱基）在转化中被完整保留，由本发明方法产生的同一套测序数据，可被同时用于分析dna甲基化（5mc）、单核苷酸变异（snv）和拷贝数变异（cnv）。这可实现在单细胞水平上对表观遗传状态与遗传背景的真正同步捕获与关联分析，为研究癌症异质性、发育分化等复杂生物学过程提供了多维视角。

28、（5）高灵敏度与准确性：单read水平的效率校正，能够有效识别并剔除因局部转化不完全或pcr偏好性引入的假阳性/假阴性甲基化信号，从而获得更高置信度的单细胞甲基化图谱，更适用于低甲基化区域或稀有细胞类型的精准分析。