一种OligodT磁珠、制备方法、应用及试剂盒与流程

本发明属于生物，具体涉及一种oligo dt磁珠、制备方法、应用及试剂盒。

背景技术：

1、在一个典型的哺乳动物细胞中，总rna的含量在10～30皮克（pg）之间，这些rna分子绝大多数为转运rna（trna）和核糖体rna（rrna），信使rna（mrna）仅占总rna的1～5 %。如果直接对总rna进行测序，绝大多数的读段将来自rrna，这不仅增加了测序成本，也使得mrna相关的数据被淹没，降低了对目标信息的检测灵敏度。因此，在进行rt-pcr、cdna文库构建、高通量测序（ngs）、northern blot等下游实验前，必须从总rna中有效分离出高纯度、完整的mrna。

2、目前常用的mrna纯化方法主要包括oligo dt亲和层析法和oligo dt磁珠法。oligo dt亲和层析法是利用mrna 3'端的poly（a）尾与固定在纤维素上的oligo（dt）之间的碱基互补配对，这种方法需要装柱、上样、多次洗涤与洗脱，回收率较低，且不适用于高通量或自动化操作。oligo dt磁珠法是将oligo dt探针固定在超顺磁珠上，oligo dt探针与含有poly（a）尾的mrna互补配对，超顺磁珠在外加磁场作用下被快速分离，经洗涤去除杂质后，用无rnase水或低盐缓冲液洗脱，即可获得高纯度mrna。这种方法操作简单，回收率高，可实现高通量和自动化，是目前的主流方法。

3、目前，行业内规模化生产及实验室常规制备oligo dt磁珠的主流技术方案主要为链霉亲和素-生物素非共价偶联工艺和化学共价偶联工艺。链霉亲和素-生物素非共价偶联的优势是配基结合特异性极强、非特异性吸附极低，制备的磁珠mrna纯化纯度高，适配高精度测序等高端实验场景；缺点是制备成本极高，规模化量产经济性差，无法适配基层实验室、大规模临床筛查及工业级核酸纯化的普及应用场景；其次是生物素与链霉亲和素的结合为非共价相互作用，相比共价结合更不稳定，易受保存环境和时间影响而脱落。化学共价偶联摒弃了链霉亲和素-生物素体系，无需昂贵标记试剂，共价结合更加稳定，适合工业级的核酸纯化；缺点是磁珠基材具有强疏水性，oligo dt探针直接偶联在磁珠表面，核酸链容易倒伏、贴附在疏水的磁珠表面，发生堆叠缠绕；制备周期过长，通常需要16～24 h的长时间反应；偶联条件未经系统性优化，偶联效率和磁珠性能有待提高。

4、申请公布号为cn114196668a的发明专利公开了一种用于捕获poly a（+）rna的磁珠、其制备方法及应用，该磁珠的制备方法为将羧基磁珠、活化剂和5'端伯氨基修饰的oligo dt探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到用于捕获poly a(+)rna的磁珠。该磁珠存在制备方法时间长，oligo(da)30载量低的问题。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一种oligo dt磁珠以解决现有oligo dt磁珠的oligo(da)载量低的技术问题。

2、本发明的第二个目的是提供一种oligo dt磁珠的制备方法。

3、本发明的第三个目的是提供一种oligo dt磁珠的应用。

4、本发明的第四个目的是提供一种试剂盒。

5、为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：

6、一种oligo dt磁珠，包括羧基磁珠、间隔臂及oligo dt探针，所述oligo dt探针通过所述间隔臂偶联在所述羧基磁珠上，所述间隔臂的氨基酸序列如seq id no：1所示。

7、进一步的，所述间隔臂与羧基磁珠通过酰胺键偶联，所述间隔臂与oligo dt探针通过酰胺键偶联；所述羧基磁珠的内核为氧化铁，外壳为聚苯乙烯，所述羧基磁珠的直径为300 nm～3 μm；所述oligo dt探针包含15～30个连续的脱氧胸腺嘧啶核苷酸，所述oligodt探针的5'端修饰有伯氨基。

8、一种oligo dt磁珠的制备方法，包括以下步骤：

9、s1：将羧基磁珠活化得到活化后的羧基磁珠；将活化后的羧基磁珠、咪唑-甜菜碱缓冲液、间隔臂母液混合后偶联反应得到间隔臂修饰的羧基磁珠；

10、s2：将间隔臂修饰的羧基磁珠加入偶联缓冲液中，随后加入oligo dt探针母液进行偶联反应得到oligo dt磁珠。

11、进一步的，s2中所述偶联缓冲液包括终浓度为50～200 mm的咪唑、50～150 mm的甜菜碱、20～100 mm的海藻糖及80～150 mm的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（edc），所述偶联缓冲液的ph为5.8～6.5，所述间隔臂修饰的羧基磁珠与偶联缓冲液的质量体积比为1 mg：580～620 μl；所述oligo dt探针母液浓度为90～110 μm；每mg所述间隔臂修饰的羧基磁珠对应加入0.3～0.9 nmol的oligo dt探针。

12、进一步的，s1中所述羧基磁珠活化为使用活化缓冲液活化；活化缓冲液包括终浓度为50～200 mm咪唑及80～150 mm的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，所述活化缓冲液的ph为5.8～6.5；所述羧基磁珠与活化缓冲液的质量体积比为1 mg：580～620 μl；所述活化的温度为20～37 ℃，时间为10～30 min。

13、进一步的，s1中所述羧基磁珠活化前还包括羧基磁珠清洗，所述羧基磁珠清洗使用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液为咪唑缓冲液，所述咪唑缓冲液包含终浓度为50～200 mm的咪唑，ph为5.8～6.5；所述羧基磁珠与咪唑缓冲液的质量体积比为1 mg：180～220 μl。

14、进一步的，s1中所述偶联反应得到间隔臂修饰的羧基磁珠的反应温度为45～55℃，时间为2.5～5 h，转速为100～200 rpm；s2中所述偶联反应得到oligo dt磁珠的反应温度为45～55 ℃，时间为2.5～5 h，转速为100～200 rpm。

15、进一步的，s1中所述咪唑-甜菜碱缓冲液包含终浓度为50～200 mm的咪唑及50～150 mm的甜菜碱，所述咪唑-甜菜碱缓冲液的ph为5.8～6.5；所述羧基磁珠与咪唑-甜菜碱缓冲液的质量体积比为1 mg：580～620 μl；所述间隔臂母液为将间隔臂溶于咪唑-甜菜碱缓冲液得到，所述间隔臂母液的浓度为0.8～1.2 mg/ml，每mg羧基磁珠对应加入0.6～1.8nmol的间隔臂。

16、进一步的，s1中所述偶联反应得到间隔臂修饰的羧基磁珠与终止封闭缓冲液混合进行封闭反应，随后用水清洗，重悬缓冲液重悬；s2中所述偶联反应得到oligo dt磁珠与所述终止封闭缓冲液混合进行封闭反应，随后用水清洗，所述重悬缓冲液重悬；所述终止封闭缓冲液含终浓度为200～400 mm氯化钠、20～50 mm柠檬酸钠及0.2 %～1 %十二烷基硫酸钠，ph为6.5～7.5。

17、进一步的，所述羧基磁珠与终止封闭缓冲液的质量体积比为1 mg：180～220 μl；所述间隔臂修饰的羧基磁珠与终止封闭缓冲液的质量体积比为1 mg：180～220 μl。

18、进一步的，所述羧基磁珠与水的质量体积比为1 mg：180～220 μl；所述间隔臂修饰的羧基磁珠与水的质量体积比为1 mg：180～220 μl。

19、进一步的，所述重悬缓冲液包含终浓度为10～200 mm的tris-hcl，ph为7.0～8.0；所述羧基磁珠与重悬缓冲液的质量体积比为1 mg：280～320 μl；所述间隔臂修饰的羧基磁珠与重悬缓冲液的质量体积比为1 mg：280～320 μl。

20、一种oligo dt磁珠在捕获mrna中的应用。

21、一种mrna分离纯化试剂盒，包含上述的oligo dt磁珠。

22、进一步的，还包括结合缓冲液、洗涤缓冲液及洗脱缓冲液；所述结合缓冲液包含终浓度为10～100 mm、ph为7.5的tris-hcl、1～5 mm的乙二胺四乙酸（edta）及0.8～1.5 m氯化锂；所述洗涤缓冲液包含终浓度为10～100 mm、ph为7.5的tris-hcl、0.5～2 mm的乙二胺四乙酸及0.1～0.2 m氯化锂；所述洗脱缓冲液为无酶双蒸水。

23、本发明的有益效果：

24、本发明使用中性肽nh2-（gly-ser）4-cooh（nh2-gsgsgsgs-cooh）作为亲水柔性间隔臂对聚苯乙烯羧基磁珠进行修饰；配合甜菜碱缓冲体系作为短肽间隔臂保护剂，引入海藻糖作为核酸保护剂，改善oligo dt探针空间舒展状态，提高反应温度缩短偶联时间，同时降低了原料在反应中的损耗，可大幅降低成本，提高了偶联效率和oligo dt磁珠的mrna捕获性能，并具有良好的长期稳定性。

25、本发明采用nh2-（gly-ser）4-cooh中性短肽作为间隔臂，nh2-（gly-ser）4-cooh整体电中性，侧链仅为羟基，无带电侧链，不会引入额外静电非特异吸附。高盐条件下间隔臂依靠羟基强水合作用不会发生塌缩，可将oligo dt探针抬离聚苯乙烯疏水磁珠表面，减少oligo dt探针倒伏堆叠，显著提高可结合poly（a）的功能性探针数量，提高mrna捕获回收率。

26、本发明中甜菜碱作为间隔臂保护剂，在高温偶联过程中维持短肽间隔臂的稳定性；海藻糖作为核酸保护剂，在高温偶联过程中保护氨基-oligo dt，降低寡核苷酸高温水解损耗，提高完整oligo dt探针占比。本发明采用45～55 ℃、2.5～5 h高温短时间偶联，相较于传统室温16～20h长时间偶联工艺，大幅缩短整体偶联工序时长，提升生产处理通量，有利于工业化批量生产，同时还能保证优异的功能性载量。

27、本发明提供了一种包含该oligo dt磁珠的mrna分离纯化试剂盒，该试剂盒将oligo dt磁珠与结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液成套配置；间隔臂修饰的羧基磁珠与试剂盒内各缓冲液体系兼容性好，可直接适配手动纯化与自动化核酸提取平台。试剂盒操作步骤简洁，mrna捕获效率高、非特异吸附低，既可以满足科研实验室小规模转录组样本处理，也适配高通量样本自动化提取，具备良好的产业化转化与市场应用前景。