过表达小麦氨基酸转运蛋白基因TaAAP2在提高小麦籽粒品质中的应用

本发明涉及小麦品质改良与分子育种，更具体的说是涉及一种利用小麦氨基酸转运蛋白基因taaap2提高籽粒总蛋白含量、蛋白组分含量及加工品质的方法。

背景技术：

1、小麦（triticum aestivum l.）是全球最重要的粮食作物之一，其籽粒品质主要由蛋白质含量、氨基酸组成及面筋特性决定。蛋白质含量和面筋强度直接影响面粉的烘烤加工性能，是小麦品质育种的核心目标。shewry系统回顾了小麦籽粒蛋白质研究的百年进展，指出面筋蛋白（谷蛋白和醇溶蛋白）的组成和含量是决定小麦加工品质的核心因素，而氨基酸向籽粒的高效转运是蛋白质积累的前提条件。当前小麦品质改良面临的主要问题包括：蛋白质含量与产量之间的负相关性；氮素利用效率低，大量施用氮肥带来环境问题；氨基酸向籽粒的转运是限制蛋白质积累的关键瓶颈；氨基酸转运蛋白家族庞大复杂，功能冗余且存在拷贝特异性。

2、因此，提供过表达小麦氨基酸转运蛋白基因taaap2在提高小麦籽粒品质中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种利用小麦氨基酸转运蛋白基因taaap2提高籽粒品质的方法，通过过表达taaap2提高小麦籽粒蛋白质含量和面筋含量，以克服现有技术中小麦品质与产量难以兼顾的难题。

2、从普通小麦中分离氨基酸转运蛋白基因taaap2及其编码蛋白。taaap2基因在普通小麦a、b、d基因组上各有一个同源拷贝，其基因座id分别为traescs2a02g268200（taaap2-2a，其编码蛋白序列如seq id no.1所示，其cds序列如seq id no.4所示）、traescs2b02g266600（taaap2-2b，其编码蛋白序列如seq id no.2所示，其cds序列如seqid no.5所示）和traescs2d02g256000（taaap2-2d，其编码蛋白序列如seq id no.3所示，其cds序列如seq id no.6所示）。

3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种小麦氨基酸转运蛋白基因taaap2，在小麦基因组中包含三个同源拷贝，分别位于2a、2b和2d染色体上，其核苷酸序列如seq id no.4（taaap2-2a）、seq id no.5（taaap2-2b）和seq id no.6（taaap2-2d）所示，各编码481个氨基酸，cds全长1446 bp。

5、进一步，由上述基因编码的小麦氨基酸转运蛋白taaap2，其氨基酸序列如seq idno.1（taaap2-2a）、seq id no.2（taaap2-2b）和seq id no.3（taaap2-2d）所示。

6、进一步，（1）小麦氨基酸转运蛋白基因taaap2的核苷酸序列（seq id no.4-6）及其所编码的蛋白（seq id no.1-3）；

7、（2）含有上述核苷酸序列的重组表达载体，包括过表达载体pubi-taaap2（玉米ubi启动子，bar筛选标记）；

8、（3）含有上述核苷酸序列的重组微生物或工程化宿主细胞；

9、（4）特异性靶向taaap2基因三个同源拷贝第4外显子保守区的crispr/cas9 sgrna靶点序列（seq id no.7，5'-ccaacttccacaagatctggtgg-3'）及其基因编辑载体pylcrispr-tau6-taaap2；

10、（5）利用上述基因编辑载体创制的taaap2三突纯合敲除株系ko-1、ko-2、ko-3及过表达纯合株系oe-1、oe-2、oe-3。

11、（6）以野生型fielder（wt）为对照，通过crispr/cas9基因敲除（ko-1/2/3三突纯合株系）和过表达（oe-1/2/3，根中表达量为wt的3.12~3.27倍）进行正反验证。

12、taaap2蛋白定位于细胞质膜，为质子依赖型氨基酸转运蛋白，对灌浆期氨基酸向籽粒的整体转运效率具有重要调控作用。

13、过表达taaap2可显著增强灌浆期氨基酸向籽粒的转运，提高籽粒总蛋白含量、谷蛋白和醇溶蛋白含量、湿面筋含量以及必需氨基酸含量，从而全面提升小麦籽粒的营养品质和加工品质。

14、验证策略：以野生型（wt，受体品种fielder）为对照，过表达转基因株系oe-1、oe-2、oe-3和crispr-cas9基因编辑三突纯合株系ko-1、ko-2、ko-3在相同栽培条件下平行比较，系统评估taaap2过表达对籽粒品质相关指标的影响，并通过ko株系反向验证taaap2在品质调控中的核心功能。

15、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了过表达小麦氨基酸转运蛋白基因taaap2在提高小麦籽粒品质中的应用，具有以下有益效果：

16、本发明首次将taaap2基因用于提高小麦籽粒品质，拓展了小麦品质改良的基因资源。显著提高籽粒总蛋白含量：过表达taaap2显著提高籽粒总蛋白含量，而敲除则导致总蛋白含量大幅下降，正向调控效果显著。显著提高谷蛋白含量（核心效果）：taaap2正向调控籽粒谷蛋白和醇溶蛋白的积累，且对谷蛋白的调控效应尤为显著。显著提高湿面筋含量（加工品质核心指标）：湿面筋含量是衡量小麦烘焙品质的关键指标，本发明显著提升了这一参数，表明taaap2过表达全面改善了小麦的加工品质。提升氨基酸营养品质：赖氨酸作为谷物第一限制性必需氨基酸，其含量的提高对于改善小麦蛋白质的营养均衡性具有重要意义（该积累为taaap2增强整体氨基酸转运能力后产生的间接效应，非taaap2直接转运赖氨酸所致）。增强灌浆期氨基酸供应：推测由于taaap2功能丧失导致氨基酸转运受阻、无法有效用于蛋白合成而异常积累，从反面进一步验证了taaap2在促进氨基酸向籽粒转运及蛋白质合成中的核心功能。ko-1/2/3三个株系表型完全相似，籽粒总蛋白含量、谷蛋白含量、醇溶蛋白含量和湿面筋含量均显著低于wt，从反向遗传学角度进一步验证了taaap2在籽粒品质调控中的核心功能。

1.过表达小麦氨基酸转运蛋白基因taaap2在提高小麦籽粒品质中的应用，其特征在于，所述基因taaap2有三个同源拷贝：taaap2-2a、taaap2-2b和taaap2-2d；所述taaap2-2a的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述taaap2-2b的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述taaap2-2d的氨基酸序列如seq id no.3所示。

2.过表达小麦氨基酸转运蛋白基因taaap2在提高小麦籽粒总蛋白含量和谷蛋白含量中的应用，其特征在于，所述基因taaap2有三个同源拷贝：taaap2-2a、taaap2-2b和taaap2-2d；所述taaap2-2a的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述taaap2-2b的氨基酸序列如seqid no.2所示，所述taaap2-2d的氨基酸序列如seq id no.3所示。

3.过表达小麦氨基酸转运蛋白基因taaap2在促进灌浆期氨基酸从营养器官向小麦籽粒转运中的应用，其特征在于，所述基因taaap2有三个同源拷贝：taaap2-2a、taaap2-2b和taaap2-2d；所述taaap2-2a的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述taaap2-2b的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述taaap2-2d的氨基酸序列如seq id no.3所示。

4.过表达小麦氨基酸转运蛋白基因taaap2在改善小麦籽粒氨基酸营养品质或培育优质小麦新品种中的应用，其特征在于，所述基因taaap2有三个同源拷贝：taaap2-2a、taaap2-2b和taaap2-2d；所述taaap2-2a的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述taaap2-2b的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述taaap2-2d的氨基酸序列如seq id no.3所示。